56份人工合成六倍體小麥的遺傳多樣性分析

王秋云，馮雯杰，張巧玲，趙 凱，張憲軍，劉淑珍，鮑印廣

(1.濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)寧 272000; 2.濟(jì)寧市任城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東濟(jì)寧 272113； 3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271008)

小麥(TriticumaestivumL.)是地球上種植最廣泛的糧食作物，占人類消耗總能量的五分之一[1]。隨著人口數(shù)量不斷增加，全球氣候變暖，耕地面積和水資源逐漸減少，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲小麥品種的需求更加迫切[2-3]。由于長期集中利用少數(shù)優(yōu)質(zhì)育種親本，導(dǎo)致現(xiàn)有育成小麥品種的遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄，遺傳多樣性逐漸縮小[4]。因此，引進(jìn)、鑒定、評價(jià)、利用國內(nèi)外優(yōu)異種質(zhì)資源，對于豐富小麥種質(zhì)資源的多樣性、拓寬小麥品種的遺傳基礎(chǔ)具有重要意義。

目前，生產(chǎn)中種植的普通小麥(TriticumaestivumL，AABBDD)是由四倍體二粒小麥(Triticumdicoccoides，AABB)與二倍體粗山羊草(Aegilopstauschii，DD)天然雜交而成[5]。由于長期的自然或人工選擇作用，其遺傳多樣性逐漸降低[6-7]。通過人工雜交和染色體加倍重現(xiàn)二粒小麥與粗山羊草之間的雜交，可以引入新的基因資源，重獲小麥起源和馴化過程中失去的許多有價(jià)值的遺傳變異。

四倍體小麥和粗山羊草的遺傳多樣性豐富，含有抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等許多優(yōu)良基因，例如在粗山羊草中鑒定出抗稈銹病基因Sr33和Sr41、抗葉銹病基Lr21、Lr22a、Lr32、Lr39、Lr42和Lr43、抗條銹病基因Yr24和Yr28以及抗白粉病基因Pm2、Pm19、Pm34和Pm35等[8-10]。它們含有與普通小麥相同的染色體基組，是普通小麥的二級基因源[11]。利用四倍體小麥與粗山羊草雜交并經(jīng)染色體加倍產(chǎn)生的合成六倍體小麥，含有雙親全部原始的遺傳變異，對小麥遺傳改良具有重要利用價(jià)值?？琢钭尩萚12]利用四倍體小麥與粗山羊草雜交，通過幼胚拯救獲得的Ps5-Y287雙二倍體(AABBDD)，其具有細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定、免疫白粉病、高抗條銹病和葉銹病等特點(diǎn)。由于合成六倍體小麥的基因組與普通小麥基因組同源，利用其與現(xiàn)代小麥品種雜交，可以通過同源重組的方式將人工合成六倍體小麥的優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←溒贩N中[13-14]。以人工合成小麥為橋梁親本的育種方式可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)基因組不同位點(diǎn)的滲入，對于產(chǎn)量等多基因控制的數(shù)量性狀的改良具有顯著作用。因此，利用人工合成小麥作為育種橋梁材料進(jìn)行小麥品種的遺傳改良，越來越受到育種家的重視[15-16]。

本研究擬對引自CIMMY的56份人工合成六倍體小麥進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀鑒定，對其高分子量谷蛋白亞基的構(gòu)成及基因組遺傳多樣性進(jìn)行分析，為其在普通小麥品種遺傳改良中的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為引自國際玉米與小麥改良中心(CIMMYT)的56份人工合成六倍體小麥，編號Syn1-Syn56(表1)，由國家小麥改良中心山東(泰安)分中心引進(jìn)并保存。對照為5個(gè)當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N：濟(jì)寧12、濟(jì)麥22、良星99、臨麥4號、鄭麥7698。

表1 56份供試人工合成六倍體小麥

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查

試驗(yàn)于2012 年10月至2019年6月在山東省濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)地進(jìn)行，每個(gè)材料種植2行，行長3 m，株距30 cm，行距50 cm。其余管理按照正常田間管理進(jìn)行。參照李立會、李秀全的《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[17]，對供試材料的株高、穗長、單株穗數(shù)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重、籽粒顏色、籽粒形狀、殼色、穎殼毛性等性狀進(jìn)行調(diào)查。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H`)采用張倩男等[18]方法計(jì)算。

1.2.2 白粉病抗性鑒定

于2014-2016年在濟(jì)寧市農(nóng)科院試驗(yàn)地常年有小麥白粉病發(fā)病地塊，進(jìn)行白粉病抗性鑒定。在田間自然發(fā)病條件下，以當(dāng)?shù)馗胁⌒←溒贩N濟(jì)寧12為對照，按照盛寶欽[19]提出的0～4級分級標(biāo)準(zhǔn)記載反應(yīng)型，鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：免疫(0)、近免疫(0；)、高抗(1)、中抗(2)、中感(3)及高感(4)。

1.2.3 高分子量谷蛋白亞基分析

采用張學(xué)勇等[20]的方法，以馬奎斯(1,7+9,5+10)和中國春(Null，7+8，2+12)為對照，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)對供試材料的HMW-GS組成進(jìn)行分析。

1.2.4 遺傳多樣性分析

采用酚-氯仿法提取植物幼嫩葉片的DNA[21]。采用涵蓋小麥基因組21條染色體的 2 492對多態(tài)性引物[22]對3個(gè)合成六倍體小麥(Syn2、Syn44、Syn54)和5個(gè)小麥栽培品種(濟(jì)寧12、濟(jì)麥22、良星99、臨麥4號、鄭麥7698)進(jìn)行了多態(tài)性分析，篩選出20對條帶清晰，多態(tài)性好的分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。擴(kuò)增反應(yīng)在TakaRa PCR thermaL cycler上進(jìn)行，采用降落PCR(Touchdown PCR)，即94 ℃變性4 min； 94 ℃變性45 s，65 ℃復(fù)性50 s(每個(gè)循環(huán)降低 1 ℃)，72 ℃延伸55 s，15個(gè)循環(huán)；94 ℃變性40 s，50 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；擴(kuò)增結(jié)束后10 ℃保存。將PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各引物的等位變異數(shù)和多態(tài)性信息量(PIC，polymorphic information content)。

式中，Pij表示位點(diǎn)i的第j個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率。PIC值的大小在0～1之間，0表示無多態(tài)性，1表示具有非常高的多態(tài)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝性狀特點(diǎn)

調(diào)查結(jié)果(表2)表明，56份供試材料株高平均為112.07 cm，變化范圍為90.00～132.00 cm，變異系數(shù)最小,為8.46%；穗長平均為15.3 cm，變化范圍是11.0～22.5 cm；單株穗數(shù)平均為 20.4個(gè)，變化范圍為5.0～45.4個(gè)，變異系數(shù)最大,為43.54%；每穗小穗數(shù)平均為17.7個(gè)，變異范圍是11.6～21.6個(gè)；穗粒數(shù)平均為35.56粒， 變異范圍22.20～67.80粒；千粒重平均為36.37 g，變異范圍為19.66～58.82 g，變異系數(shù)為27.90%。千粒重的多樣性指數(shù)最高，單株穗數(shù)次之。

表2 供試材料主要農(nóng)藝性狀的變異特點(diǎn)

大部分材料的籽粒顏色為紅色，籽粒形狀呈長圓形，殼色多為白色，且穎殼多為無毛性。

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，供試材料具有繁茂性好、植株較高等特點(diǎn)。多數(shù)材料具有極強(qiáng)的分蘗成穗能力，如Syn1、Syn2、Syn56等材料的單株成穗數(shù)在10穗以上，Syn46的單株穗數(shù)平均達(dá)到達(dá)到45.4個(gè)；有的材料如Syn19、Syn30等穗粒數(shù)較多，平均達(dá)到50粒以上；Syn52、Syn50、Syn54等材料的千粒重較高，達(dá)50～60 g。

2.2 供試材料的白粉病抗性

以當(dāng)?shù)馗胁⌒←溒贩N濟(jì)寧12為對照，在田間自然發(fā)病條件下，連續(xù)三年對供試材料白粉病抗性鑒定。結(jié)果表明，56份供試材料中Syn4、Syn23、Syn24、Syn32、Syn33、Syn40、Syn43、Syn54、Syn55共9份材料在田間表現(xiàn)為免疫或近免疫，占所有供試材料的16.1%；Syn8、Syn12、Syn15、Syn16、Syn17、Syn18、Syn22、Syn25、Syn26、Syn27、Syn29、Syn31、Syn35、Syn36、Syn39、Syn41、Syn42、Syn45、Syn47、Syn50、Syn51、Syn52、Syn53共23份材料表現(xiàn)高抗白粉病，占所有供試材料的41.1%；Syn1、Syn2、Syn3、Syn9、Syn13、Syn19、Syn20、Syn34、Syn44、Syn46、Syn48、Syn49、Syn56共13份材料表現(xiàn)中抗白粉病，占供材料的23.2%；有19.6%的材料表現(xiàn)中感小麥白粉病，主要是Syn5、Syn6、Syn7、Syn10、Syn11、Syn14、Syn21、Syn28、Syn30、Syn37、Syn38等。綜上，供試材料中有77%以上的材料對白粉病具有良好的抗性。

2.3 供試材料的高分子量谷蛋白亞基組成

從圖1、表3和表4可以看出，供試份材料在編碼高分子量麥谷蛋白亞基的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1這3個(gè)基因位點(diǎn)上表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，共有35種HMW-GS等位變異。其中，Glu-A1、 Glu-B1、 Glu-D1位點(diǎn)上分別有3、15、17種等位變異類型。從不同亞基的出現(xiàn)頻率看，在Glu-A1位點(diǎn)上的3種變異類型(1，2*，null)中，null亞基頻率最高，為51.8%，1亞基次之 (44.6%)，2*亞基最少(3.6%)。Glu-B1位點(diǎn)上的亞基類型豐富，檢測到15種亞基類型，其中7+8亞基出現(xiàn)頻率最高，為25%；其次為17+18，為 12.5%；再次為13+16，為10.7%；還檢測到6、7+8+9、8+20等稀有亞基類型。在Glu-D1位點(diǎn)的17種亞基類型中，2+12亞基最多，頻率為30.4%；其次是優(yōu)質(zhì)亞基5+10，占12.5%；同時(shí)還檢測出5+12亞基類型，占5.4%。

表3 供試材料的高分子量谷蛋白亞基組成

表4 供試材料的HMW-GS在不同位點(diǎn)的變異類型及其頻率

1:Syn39; 2:Syn40; 3:Syn41; 4:Syn42; 5:Syn43; 6:Syn44; 7:Syn45; 8:Syn46; 9:Syn47; 10:Syn48; 11:Syn49;12:Syn50; 13:Syn51; 14:Syn52; 15:Syn53; 16:Syn54; 17:Syn55; 18:煙優(yōu)361 Yanyou 361; 19:馬奎斯 Makuis; 20:中國春 Chinese Spring.

此外，還在10份材料中檢測到一種新的亞基，暫命名為Sx。該亞基的分子量比目前已知分子量最小的12亞基還小，而且單獨(dú)表達(dá)或與2、5、12等亞基呈雙亞基、三亞基、四亞基組合的形式出現(xiàn)，如5+10+Sx、2+10+Sx、2+2+Sx和 5+10+2+Sx等。

上述結(jié)果表明，供試材料Glu-1位點(diǎn)上的亞基變異類型非常豐富，除含有多種優(yōu)質(zhì)亞基或亞基組合外，還含有新的亞基類型，因此在小麥加工品質(zhì)性狀的遺傳改良中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 遺傳多樣性

選擇田間農(nóng)藝性狀較好的材料Syn2、Syn44和Syn54(圖2)與5個(gè)當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N濟(jì)寧12、濟(jì)麥22、良星99、臨麥4號、鄭麥7698，進(jìn)行了全基因組遺傳多態(tài)性分析。用篩選出的20對條帶清晰、多態(tài)性較好的引物(表5)進(jìn)行擴(kuò)增分析，結(jié)果(圖2)表明，Xgwm312在供試材料中可擴(kuò)增出3種等位變異，在栽培品種中可以擴(kuò)增出2種等位變異。20對引物在供試材料中共檢測到94個(gè)等位變異。平均每對引物在3個(gè)人工合成小麥中能檢測到2.9個(gè)等位變異，PIC值為0.65；在5個(gè)栽培品種中檢測到1.8個(gè)等位變異，PIC值為 0.28。說明人工合成小麥的遺傳多樣性高于栽培品種。

A:Syn54灌漿期； B:Syn54成熟期；C和D中:1.濟(jì)寧12,2.Syn2,3.Syn44,4.Syn54,5.良星99,6.臨麥4號,7.濟(jì)麥22,8.鄭麥7698。

表5 SSR引物在部分供試材料中的擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

由于長期集中利用少數(shù)骨干親本材料，導(dǎo)致現(xiàn)代育成小麥品種的遺傳相似性增加，遺傳多樣性減少，降低了小麥品種的適應(yīng)性，產(chǎn)量水平也難有新的突破。如何拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ)是當(dāng)前廣大小麥育種家急待解決的重要課題。

利用四倍體小麥和粗山羊草雜交獲得的六倍體人工合成小麥，具有豐富的遺傳多樣性，含有許多在小麥育種中具有利用價(jià)值的優(yōu)異基因，它已作為拓寬普通栽培小麥品種遺傳多樣性的新種質(zhì)資源，日益受到育種家的重視。葉亞青[23]對9個(gè)人工合成小麥的S1代形態(tài)學(xué)研究表明，栽培二粒小麥與粗山羊草的人工合成小麥遺傳了粗山羊草的高分蘗特征，但是植株的高度則具有栽培二粒小麥的特點(diǎn)。陳國躍[24]分別以97份引自國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)人工合成六倍體小麥和中國農(nóng)科院品資所的16份人工合成六倍體小麥為材料，對其進(jìn)行了抗條銹病和白粉病鑒定：證明有48份材料對條銹病生理小種條中31、條中32和水源14表現(xiàn)抗性，54份材料對小麥白粉病菌15號生理小種具有抗性，其中16份材料表現(xiàn)為免疫或近免疫。本研究對引自CYMMIT的56份人工合成小麥材料進(jìn)行了農(nóng)藝性狀鑒定，結(jié)果表明，供試材料的性狀變異主要集中在千粒重和單株穗數(shù)等產(chǎn)量性狀上，整體穗粒數(shù)較多，分蘗成穗多。單株穗數(shù)在10個(gè)以上的占到全部材料的91%，高于平均值20.44個(gè)的有25份，Syn46的單株穗數(shù)達(dá)到45.4個(gè)。這表明六倍體人工合成小麥具有較高的分蘗成穗潛能，在小麥單株穗數(shù)的遺傳改良中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。在抗白粉病方面，Syn4、Syn23、Syn24等9份材料在田間表現(xiàn)免疫或近免疫，占所有供試材料的16.1%，Syn8、Syn12、Syn15等23份材料表現(xiàn)高抗白粉病，占41.1%，Syn1、Syn2、Syn3等13份材料表現(xiàn)中抗白粉病，占比23.2%。說明多數(shù)供試材料對白粉病具有良好的抗性，在小麥抗白粉病育種方面具有利用價(jià)值。

對供試材料的HMW-GS組成進(jìn)行分析，共檢測到35種HMW-GS等位變異。其中，Glu-A1位點(diǎn)上有3 種等位變異類型；Glu-B1 位點(diǎn)有15種等位變異類型，Glu-D1 位點(diǎn)檢測到17種等位變異類型。鑒定出優(yōu)質(zhì)亞基17+18、13+16、2*、5+10等亞基和重組的亞基類型：5+12。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些新的未知亞基或亞基組合。這與陳國躍[24]對人工合成六倍體小麥高分子量麥谷蛋白亞基研究結(jié)果相似，但發(fā)現(xiàn)的亞基變異類型更多，并出現(xiàn)了四亞基組合類型5+10+2+Sx等，表明供試材料在小麥加工品質(zhì)性狀的遺傳改良中可能具有重要利用價(jià)值。其中新亞基對小麥加工品質(zhì)性狀的影響有待進(jìn)一步研究。

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記具有操作方便、成本低廉等特點(diǎn)，已經(jīng)被大量地應(yīng)用到包括小麥族在內(nèi)的許多物種的遺傳多樣性評價(jià)研究中[25-27]。Lelley等[28]利用SSR標(biāo)記技術(shù)，對粗山羊草和普通小麥的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，在每個(gè)SSR位點(diǎn)上所檢測到的等位變異都比在栽培小麥品種中的多[28]。本研究用20對SSR分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，供試的人工合成小麥中擴(kuò)增出更多的等位變異類型。因此，人工合成小麥具有較高的遺傳多樣性。

本研究結(jié)果為供試材料的后續(xù)研究和有效利用提供了參考，奠定了基礎(chǔ)。