青海省BYDV株系鑒定及BYDV-GAV燕麥分離物基因組序列的測(cè)定與分析

喬世英，季英華，魏有海，閆佳會(huì)，郭青云

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)試驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，青海西寧 810016； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)試驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014)

大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus，BYDV)引起的小麥黃矮病是一種全球范圍內(nèi)的麥類作物病害，該病害最早在美國(guó)的加利福尼亞州被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]，此后陸續(xù)在土耳其[2]、法國(guó)[3]、巴西[4]、巴基斯坦[5]等地流行并報(bào)道。我國(guó)小麥黃矮病最早發(fā)生于20世紀(jì)六七十年代，在主要的糧食作物種植區(qū)均有大面積流行，對(duì)我國(guó)糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。近幾年，小麥黃矮病在全國(guó)范圍內(nèi)的流行發(fā)生趨勢(shì)減弱，但在青海省的小麥產(chǎn)區(qū)仍有較大面積的發(fā)生[6-7]。

BYDV為黃癥病毒科(Luteovidae)單鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約 5.7 kb，蚜蟲(chóng)是其主要的傳毒介體[8-9]。該病毒侵染小麥后，植株變矮，葉片由葉尖至葉柄處逐漸變黃，在小麥抽穗期會(huì)產(chǎn)生不抽穗或穗發(fā)育不良的癥狀[10-12]；燕麥被侵染后會(huì)出現(xiàn)紅葉病，在染病后期被侵染葉片褪綠變紅，相對(duì)于健康葉片有明顯的增厚，危害嚴(yán)重時(shí)，葉片后期褪綠變?yōu)樽仙玔13-14]。BYDV株系的劃分主要依據(jù)其蚜蟲(chóng)的傳播?；裕趪?guó)際分類上，BYDV株系可劃分BYDV-RPV、BYDV-RMV、BYDV-SGV、BYDV-PAV和BYDV-MAV 5個(gè)株系；國(guó)內(nèi)學(xué)者將BYDV株系劃分為BYDV-GAV、BYDV-GPV、BYDV-PAV和BYDV-RMV 4個(gè)株系，其中，BYDV-RPV株系由禾谷縊管蚜(Rpopalosiphumpadi)傳播，BYDV-RMV株系由玉米蚜(R.maidis)傳播，BYDV-SGV株系由麥二叉蚜(Schizaphisguaminum)傳播，BYDV-PAV株系由禾谷縊管蚜和麥長(zhǎng)管蚜(Sitobionavenae)傳播，BYDV-MAV株系由麥長(zhǎng)管蚜傳播，BYDV-GAV株系由麥二叉蚜和麥長(zhǎng)管蚜傳播，BYDV-GPV株系由麥二叉蚜和禾谷縊管蚜傳播[15-16]，其中BYDV-GAV為我國(guó)流行株系，BYDV-GPV為我國(guó)特有株系[17]。

小麥、青稞、燕麥[18]是青海省的主要麥類種植作物，近年來(lái)黃矮病不斷發(fā)生，對(duì)我省作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。翟 浩等[12]對(duì)青海省西寧市、互助縣、樂(lè)都縣及貴德縣小麥田間疑似黃矮病樣品進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)BYDV-GAV為青海省小麥黃矮病的主要流行株系。李廷芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)，青海省青稞分離物與BYDV-GAV渭南小麥分離物親緣關(guān)系較近，是中國(guó)BYDV-GAV的一個(gè)分離物。但目前有關(guān)整個(gè)青海省主要糧食作物種植區(qū)BYDV流行株系尚未見(jiàn)報(bào)道，且青海省燕麥BYDV-GAV株系全基因組也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以采集到的90份全省糧食作物種植區(qū)田間疑似黃矮病樣品為試驗(yàn)對(duì)象，采樣地點(diǎn)覆蓋到各州縣，避免局部地區(qū)采樣的弊端，對(duì)所有采集樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，明確青海省BYDV的流行株系，并通過(guò)分子克隆技術(shù)獲得燕麥BYDV-GAV全基因組序列，全面闡述了青海省小麥黃矮病的發(fā)生情況、流行株系分布等，以期為后期小麥黃矮病抗病品種的選育及病害防治工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年7月至9月在青海省各州縣采集田間小麥(53份)、青稞(12份)、燕麥(25份)黃矮病疑似樣品共90份，分別采自西寧市(13份)、海東市(25份)、海西州(23份)、海南州(21份)、黃南州(4份)和玉樹(shù)州(4份)。樣品采集后立即凍存于液氮罐中，帶回試驗(yàn)室存于-80 ℃冰箱。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用NCBI網(wǎng)站與軟件Primer Primer 5設(shè)計(jì)本試驗(yàn)所需的檢測(cè)引物與全基因組擴(kuò)增引物，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 本研究用到的引物信息

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA的提取

取待測(cè)樣品50～100 mg，采用Trizol法提取總RNA，提取的RNA用25 μL的RNase Free ddH2O進(jìn)行溶解并保存于 -80 ℃冰箱中。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)

采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL，包括RNA 1 μL，PrimeScriptTMRT Master Mix 4 μL，RNase Free ddH2O補(bǔ)足到20 μL，反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s，反應(yīng)終止后將樣品迅速置于冰上，并保存于-20 ℃冰箱中。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司) 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，RNase Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，退火45 s(各引物退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃ 3.5 min，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 燕麥BYDV-GAV全基因組序列的克隆

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行一系列試驗(yàn)操作。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括cDNA 1 μL，2×Phata Max Buffer(南京諾唯贊生物科技有限公司)12.5 μL，Phata Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 3.5 min，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃補(bǔ)充延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。取 3 μL PCR產(chǎn)物與5×Loading buffer混合后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選取較亮的目的條帶，利用Axygen公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，回收產(chǎn)物連接至pEASY-Blunt Zero克隆載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，選取陽(yáng)性克隆 送測(cè)。

1.3.4 序列分析

利用DNAStar軟件進(jìn)行序列比對(duì)及拼接等，所得基因組序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.n/m.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間植株癥狀

田間植株感染BYDVS后癥狀主要表現(xiàn)為植株明顯變矮、葉黃化等癥狀。小麥上的癥狀一般為植株葉片從葉尖開(kāi)始變黃，葉片顯現(xiàn)黃綠相間條紋，植株變矮，叢枝等；燕麥感染BYDV后表現(xiàn)為燕麥紅葉病，植株葉片明顯變紅增厚，危害嚴(yán)重時(shí)葉尖完全褪綠枯死，下部葉片呈紫紅色；青稞受BYDV侵染后，主要表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)黃綠相間的條紋，植株明顯變矮(圖1)。

圖1 青海省小麥、燕麥和青稞田間病害癥狀

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

利用引物GAV-F/R、PAVL1/R1、MAVL1/R1、SGVL2/R2、RMVL1/R1、RPVL/R對(duì)所有黃矮病疑似樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，部分樣品利用引物GAV-F/R、RPVL/R、MAVL1/R1、SGVL2/R2和PAVL1/R1擴(kuò)增可分別得到約600、400、200、250和250 bp的目的條帶。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，部分樣品存在病毒株系復(fù)合侵染的現(xiàn)象，除能檢測(cè)到BYDV-GAV株系外，還能檢測(cè)到其他株系。如在小麥樣品中，19QGW2、19QJW2、19QJW3同時(shí)檢測(cè)到BYDV-GAV和BYDV-MAV株系，19QJW4同時(shí)檢測(cè)到BYDV-GAV和BYDV-RPV株系，19QHW2、19QXW1、19QAW3同時(shí)檢測(cè)到BYDV-MAV、BYDV-GAV和BYDV-RPV株系，19QRW4同時(shí)檢測(cè)到BYDV-GAV、BYDV-RPV和BYDV-PAV株系；在燕麥樣品中，19QGO2同時(shí)檢測(cè)到BYDV-MAV、BYDV-GAV和BYDV-RPV株系，19QLO1、19QPO1、19QBO1、19QDO2同時(shí)檢測(cè)到與BYDV-MAV和BYDV-GAV株系，19QDO1同時(shí)檢測(cè)到BYDV-GAV和BYDV-SGV株系；在青稞樣品中，19QNB1、19QPB1同時(shí)能檢測(cè)到BYDV-MAV和BYDV-GAV株系。

A：引物GAV-F/R的部分樣品擴(kuò)增結(jié)果；B：引物RPVL/R的部分樣品擴(kuò)增結(jié)果；C：引物MAVL1/R1的部分樣品擴(kuò)增結(jié)果；D：引物SGVL2/R2的部分樣品擴(kuò)增結(jié)果；E：引物PAVL1/R1的部分樣品擴(kuò)增結(jié)果。Maker：DL5000；其他泳道為供試材料在采集樣品中的代號(hào)，其中19代表采集年份2019，第一個(gè)字母Q代表青海省，第二個(gè)字母代表采樣地點(diǎn)(G表示貴德縣，D表示都蘭縣，N表示貴南縣，P表示共和縣，L表示樂(lè)都縣，J表示尖扎縣，H表示化隆縣，X表示循化縣，A表示平安縣，M表示民和縣，R表示湟中縣，B表示德令哈市，Z表示互助縣，T表示大通縣)，第三個(gè)字母代表寄主(W為小麥，O為燕麥，B為青稞)，CK1～CK3分別代表健康小麥、燕麥、青稞 植株。

2.3 不同寄主、地區(qū)BYDV株系的分布情況

檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，BYDV-GAV為青海省主要流行株系，檢出率為90.0%，其他株系檢出率表現(xiàn)為BYDV-MAV(51.1%)>BYDV-RPV(7.8%)>BYDV-PAV(6.7%)=SGV (6.7%)。采集樣品感染BYDV的植株中，小麥占主要部分，其他依次為燕麥、青稞。從株系看，BYDV-GAV株系在小麥和燕麥樣品中檢出率較高，分別為 92.5%和92.0%，BYDV-PAV株系在青稞中檢出率最高，為16.7%；BYDV-MAV株系在小麥中檢出率較高，為58.5%；BYDV-RPV株系在小麥中檢出率最高，為9.4%；BYDV-SGV株系在小麥中檢出率最高，為9.4%，但其在青稞樣品中未被檢測(cè)到。方差分析結(jié)果顯示，不同寄主不同株系間無(wú)顯著差異。少量樣品中也檢測(cè)到BYDV-GPV株系的侵染，后期對(duì)該株系進(jìn)行了進(jìn)一步的克隆與驗(yàn)證(待發(fā)表)。

表2 不同寄主感染BYDV的檢測(cè)結(jié)果

從表3可以看出，BYDV-GAV株系在西寧市、海東市、黃南州樣品中檢出率較高，均超過(guò)90%，其他依次為玉樹(shù)州、海西州、海南州，均超過(guò)60%；BYDV-PAV株系在西寧市、海東市、黃南州、玉樹(shù)州樣品中均檢測(cè)到，但所占比例較小，在海南州和海西州未檢測(cè)到BYDV-PAV株系；BYV-MAV株系在西寧市、海東市、海南州、黃南州樣品中檢出率都為50%左右，但海西州檢出率較低，為26.1%，玉樹(shù)州樣品中未檢測(cè)到該株系；BYDV-RPV株系只在西寧市、海東市、黃南州樣品中檢測(cè)到，且所占比例較小，在海南州、海西州、玉樹(shù)州樣品中未檢測(cè)到該株系；BYDV-SGV株系在西寧市、海東市、海南州、海西州均檢測(cè)到，但該株系所檢測(cè)到的樣品數(shù)極少，且在黃南州和玉樹(shù)州樣品中未檢測(cè)到該株系。經(jīng)方差分析，不同地區(qū)不同株系間無(wú)顯著差異。

表3 青海省各市(州)小麥黃矮病株系的分布

2.4 青海省BYDV-GAV燕麥分離物的分子鑒定結(jié)果及全基因序列分析

2.4.1 BYDV-GAV燕麥分離物分子鑒定結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的BYDV-GAV 特異性引物 GAV-F/R對(duì)采集到的25份燕麥樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，部分燕麥樣品擴(kuò)增到大小約600 bp的條帶，與目的條帶(600 bp)大小一致。

Maker：DL 5000 marker；CK：健康燕麥植株；19QGO1～19QTO1：燕麥樣品，字母代表含義詳見(jiàn)圖2。

2.4.2 BYDV-GAV燕麥分離物全基因組克隆及序列分析

為進(jìn)一步確定病毒株系，選取其中一個(gè)燕麥樣品(19QPO3)進(jìn)行BYDV-GAV的全基因組克隆。根據(jù)BYDV-GAV(EU402390)基因組序列特征，分段設(shè)計(jì)引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR克隆青海省BYDV-GAV燕麥分離物全基因組序列(圖4)。以典型樣品19QPO3總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，得到2.8 kb左右的目的條帶(圖5)。

圖4 BYDV-GAV分段擴(kuò)增策略

圖5 用引物BYDV-1bsF/1R和BYDV-2bsF/2xmR擴(kuò)增出的條帶

應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)與序列拼接，發(fā)現(xiàn)19QPO3的基因組全長(zhǎng)為5 685 bp，包括6個(gè)開(kāi)放閱讀框和4個(gè)非編碼區(qū)。對(duì)19QPO3進(jìn)行BLAST分析可知，其與中國(guó)的BYDV-GAV序列同源性較高(96.85%～ 98.08%)(表4)。系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖6)可以看出，19QPO3聚類到中國(guó)BYDV-GAV小麥分離物的分支上。綜合上述結(jié)果可得，本試驗(yàn)所得燕麥分離物為中國(guó)BYDV-GAV的一個(gè)分離物。

各枝上的數(shù)字是1 000次Bootstrap自導(dǎo)復(fù)制的置信度?！瘢罕驹囼?yàn)測(cè)定的青海省燕麥分離物；○：之前報(bào)道的青海省青稞分離物。

表4 聚類分析中所涉及的序列信息

在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上，BYDV-GAV分為三個(gè)組，中國(guó)的BYDV-GAV分離物聚類到兩個(gè)組內(nèi)，其中陜西渭南的三個(gè)分離物(登錄號(hào)：EU402389、EU402388和EU402390)、楊凌的兩個(gè)分離物(登錄號(hào)：EU402386和KF523380)、陜西扶風(fēng)的一個(gè)分離物(登錄號(hào)：KF523381)與中國(guó)的其他三個(gè)分離物(登錄號(hào)：AY220739、AY610953和AY610954)共同聚類到一個(gè)組上(Cluster I)。陜西鳳翔的一個(gè)分離物(登錄號(hào)：EU402387)、渭南的兩個(gè)分離物(登錄號(hào)：EU402391和KF523379)、安康的一個(gè)分離物(登錄號(hào)：KF523378)和甘肅天水的一個(gè)分離物(登錄號(hào)：KF523382)共同聚類到一個(gè)組上(Cluster II)。愛(ài)沙尼亞的兩個(gè)分離物(登錄號(hào)：MK012662和MK012663)聚類到一個(gè)組上(Cluster III)。其中，本試驗(yàn)所得燕麥分離物19QPO3聚類到第一組內(nèi)，與陜西楊凌的兩個(gè)分離物親緣關(guān)系較近，同源性較高，分別為97.82%和97.94%，與之前在青海省所得的青稞分離物聚類到不同小支上[19]，同源性相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 討 論

小麥在世界糧食作物中占據(jù)重要地位，在我國(guó)的麥類糧食作物中亦占據(jù)著重要地位[20]。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，造成小麥病毒病害的病原主要有大麥黃矮病毒(BYDV)，小麥矮縮病毒(WDV)、小麥條紋花葉病毒(WSMV)等[21-22]。晉治波[23]通過(guò)試驗(yàn)得到中國(guó)BYDV-GAV基因組全序列，并進(jìn)行相關(guān)序列分析，結(jié)果表明，該病毒株系包含6個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼4個(gè)主要蛋白。

青海省地處青藏高原，地理位置較為特殊，主要種植小麥、燕麥和青稞，本試驗(yàn)采集了青海省6個(gè)州市的田間小麥黃矮病疑似病樣進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。病樣的采集結(jié)果因青海省種植區(qū)域分布的不同存在一定的差異。檢測(cè)結(jié)果表明，青海省小麥黃矮病株系的分布不管是從寄主區(qū)分還是從地理環(huán)境區(qū)分，其主要流行株系均為BYDV-GAV株系，與劉 楠等[24]、翟 浩等[12]的檢測(cè)鑒定結(jié)果相一致。試驗(yàn)結(jié)果也顯示，所采集樣品除存在BYDV-GAV株系與其他株系復(fù)合侵染的現(xiàn)象外，也存在少量的BYDV-PAV、BYDV-SGV株系的復(fù)合侵染現(xiàn)象，對(duì)于這一結(jié)果的產(chǎn)生還需進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。此次試驗(yàn)病樣的采樣地點(diǎn)分布于整個(gè)青海省，部分采樣點(diǎn)間海拔跨度較大，地理環(huán)境相差較大，植株所處生長(zhǎng)期不同，發(fā)病時(shí)期不一致，這些因素對(duì)于檢測(cè)結(jié)果都存在一定的影響。

通過(guò)本試驗(yàn)所得的燕麥分離物19QPO3與已報(bào)道的BYDV-GAV分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，19QPO3與已報(bào)道的中國(guó)BYDV-GAV分離物聚類到一個(gè)分支上，說(shuō)明19QPO3為中國(guó)BYDV-GAV的一個(gè)分離物，且與陜西楊凌小麥分離物(登錄號(hào)：KF523380)親緣關(guān)系相對(duì)較近。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可見(jiàn)，本試驗(yàn)所得的BYDV-GAV燕麥分離物19QPO3與之前得到的青海青稞分離物14Qh8-1[19]雖共同聚類到一個(gè)組內(nèi)，但分布在不同支上，且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是寄主基因突變、地理環(huán)境等因素的影響，但還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

近年來(lái)，青海省小麥黃矮病的發(fā)生呈現(xiàn)日漸嚴(yán)重的趨勢(shì)，因此對(duì)于該病害的研究具有一定的科學(xué)意義。研究并確定青海省小麥黃矮病的主要流行株系，可更好地了解小麥黃矮病在青海省內(nèi)的發(fā)生流行趨勢(shì)，為該病害的防治提供一定的理論參考。本試驗(yàn)獲得的青海省BYDV-GAV燕麥分離物的基因組全長(zhǎng)序列為后期試驗(yàn)的進(jìn)行提供部分參考依據(jù)，也為進(jìn)一步探究該病害在青海省內(nèi)的發(fā)生流行趨勢(shì)及該病害的進(jìn)化變異規(guī)律提供一定的理論基礎(chǔ)。