煙草青枯病拮抗菌的分離篩選與抑菌活性物質(zhì)研究

湯鳴強(qiáng)，林天然，李小芳，周曉勤，曾文龍，林曉路，彭水蓮

（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清 350300；2.現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)福建省高校工程研究中心，福建 福清350300；3.福建省煙草公司龍巖市公司，福建 龍巖 364000；4.龍巖市煙草公司長汀分公司，福建 長汀 366300）

煙草青枯病是一種土傳性細(xì)菌病害，由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasol anacearm）侵染而引起［1］。該病菌株系表現(xiàn)型與基因型多樣化，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可感染250多種植物［2］。煙草青枯病普遍發(fā)生于中國長江流域及其以南地區(qū)，近年來福建、廣東及云南等局部地區(qū)均發(fā)生過嚴(yán)重的病害，平均發(fā)病率高達(dá)30%～85%，使得煙草產(chǎn)量和品質(zhì)下降［3］，在部分重病區(qū)經(jīng)常導(dǎo)致全田發(fā)病、絕產(chǎn)無收。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)煙草青枯病的防治開展了廣泛的研究，涉及栽培管理、抗病品種選育、化學(xué)藥劑防治和生物防治等方面。其中，化學(xué)藥劑防治仍是控制煙草青枯病的主要技術(shù)手段［4，5］，但長期大量使用化學(xué)藥劑容易導(dǎo)致病原菌抗性增加，并造成環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品有害物質(zhì)殘留超標(biāo)。生物防治具有經(jīng)濟(jì)、無公害、效果長久等優(yōu)點(diǎn)，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，其中拮抗放線菌及其代謝產(chǎn)物的分離篩選一直是植物病害生物防治的重要內(nèi)容，對(duì)煙草生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)意義重大［6］。張薇［7］從土壤中篩選到一株放線菌Y23對(duì)煙草青枯病菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，其抑菌圈直徑達(dá)13.4 mm，菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)紫外光和熱穩(wěn)定性較好。陸錚錚等［8］采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，分離篩選到3株煙草青枯病菌拮抗放線菌，分別為玫瑰暗黃鏈霉菌、橄欖綠鏈霉菌和黃麻鏈霉菌。羅文建等［9］從健康煙田根際土壤中分離到對(duì)青枯雷爾氏菌具有明顯拮抗作用的鏈霉菌LC-7，該菌株對(duì)煙草青枯病具有顯著的防治效果，防效為85.48%。

本研究從福建省龍巖市上杭縣煙區(qū)健康煙株根際土壤分離到多株青枯病拮抗放線菌，其中，菌株FQ-7的拮抗活性最強(qiáng)，通過形態(tài)培養(yǎng)特征觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列測定，確定菌株FQ-7的分類地位。菌株FQ-7發(fā)酵液提取物經(jīng)萃取濃縮，研究其在不同溫度、不同pH及不同紫外光照射時(shí)間下的穩(wěn)定性，為該菌株應(yīng)用于煙草青枯病的生物防治提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品 采自福建省龍巖市上杭縣下枋村煙區(qū)健康煙草周圍的土壤，采集時(shí)間為2019年5月。對(duì)土壤樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗?，將其用無菌樣品袋密封，做好標(biāo)記，放入冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試病原菌與煙草品種 煙草青枯病菌XQ23菌株分離自福建省龍巖市上杭縣廬豐畬族鄉(xiāng)煙田土壤，分離菌株置于25%甘油中，-80℃保存。供試煙草品種為云煙87，由福建省煙草公司龍巖市分公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基每升含可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g。發(fā)酵培養(yǎng)基每升含大豆粉30.0 g，可溶性淀粉20.0 g，CaCO32.0 g，NaCl 2.0 g。營養(yǎng)肉湯（NA）培養(yǎng)基每升含牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0～7.2。菌株形態(tài)培養(yǎng)觀察以及生理生化試驗(yàn)所用培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)配制［10-12］。

1.2 拮抗菌的分離與篩選

1.2.1 拮抗菌分離 按照稀釋分離法制備土壤懸液并進(jìn)行稀釋，制成不同稀釋度的土壤懸液。吸取不同稀釋度的土壤懸液于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，均勻涂布，置于28℃恒溫培養(yǎng)4 d。選擇干燥、不透明、表面呈緊密絲絨狀的單菌落劃線接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，分離純化3～5次，得到9株放線菌菌株，依次編號(hào)為FQ-1至FQ-9，純化后置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 拮抗菌的篩選 以煙草青枯病菌XQ23菌株為靶標(biāo)菌，采用雙層瓊脂法篩選拮抗菌。供試菌株經(jīng)活化后接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，取菌塊置于平板中央。每菌株3次重復(fù)，28℃定殖培養(yǎng)4 d。取15 mL經(jīng)活化的含有煙草青枯病菌XQ23的NA培養(yǎng)基，覆蓋于上述平板。以不加拮抗菌菌塊為對(duì)照，置于28℃恒溫培養(yǎng)1 d后觀察抑菌情況。將初篩得到的拮抗菌接種于20 mL種子培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h作為種子液。取3 mL種子液移入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d（28℃、200 r/min），離心10 min（4℃、8 000 r/min），上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后備用。用瓊脂擴(kuò)散法測定其抑菌活性，即將煙草青枯病菌制成菌懸液加入到NA培養(yǎng)基中，混合均勻，倒成平板，凝固后用無菌打孔器在含菌平板中打孔，每孔中加入拮抗菌發(fā)酵液100μL，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.3 拮抗菌的鑒定

觀察描述菌株FQ-7在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下的形態(tài)特征。參照文獻(xiàn)［11，13］，進(jìn)行菌株FQ-7培養(yǎng)特性和生理生化試驗(yàn)。菌株FQ-7 16S rDNA序列測定參照葉海霞等［14］的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送科標(biāo)技術(shù)（青島）研發(fā)中心進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)在線分析，同GenBank中的有關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 拮抗菌FQ-7抗菌活性物質(zhì)分離及其特性

1.4.1 抗菌活性物質(zhì)的分離 拮抗菌FQ-7在種子培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24 h后移入液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d（200 r/min），發(fā)酵液經(jīng)離心取上清液（4℃，8 000 r/min），上清液與乙酸乙酯按照1∶1比例振蕩混合1 h后靜置萃取，將所得萃取液合并濃縮至5倍濃度，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后即為粗提液。

1.4.2 拮抗菌FQ-7抗菌活性物質(zhì)的檢測 參照“1.2.2”描述的瓊脂擴(kuò)散法檢測不同處理下拮抗菌FQ-7抗菌活性物質(zhì)的抑菌效果。每個(gè)處理重復(fù)5次，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌水作陰性對(duì)照，30 μg/mL慶大霉素作陽性對(duì)照。

1.4.3 拮抗菌FQ-7抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性分析大量制備拮抗菌FQ-7發(fā)酵液，按照“1.4.1”的方法，獲得抑菌活性物質(zhì)乙酸乙酯萃取物，經(jīng)適當(dāng)濃縮后將 其 置 于 不 同 溫 度（40、60、80、100、110、115、121℃）、不同pH緩沖體系（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）和不同紫外燈照射時(shí)間（30、60、120 min），功率8 W，燈距20 cm處理，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測拮抗菌FQ-7抗菌活性物質(zhì)的抑菌效果，以30μg/mL硫酸慶大霉素為對(duì)照，考察其對(duì)熱、pH和紫外光處理的穩(wěn)定性。相對(duì)抑菌活性=（處理組抑制菌直徑/對(duì)照組抑菌圈直徑）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 9.1作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 17.0軟件完成，利用LSD多重比較法檢測處理間差異顯著性，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離

采用稀釋涂布法從健康煙株根際土壤中分離得到9株放線菌，用雙層瓊脂法進(jìn)行初篩。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株FQ-7對(duì)煙草青枯病菌有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑可達(dá)16.3 mm（圖1A）。

2.2 拮抗菌FQ-7形態(tài)特征

將拮抗菌FQ-7接種于高氏一號(hào)固體平板上，28℃培養(yǎng)7 d。菌落形態(tài)特征：干燥、不透明，表面呈緊密的絲絨狀，上面有一層淺藍(lán)色的粉狀孢子。菌落與培養(yǎng)基連接緊密，難以挑取。該菌分泌水溶性色素，菌落表面呈淡藍(lán)色，色素滲透入培養(yǎng)基，變成深藍(lán)色（圖1B）。光學(xué)顯微鏡下，該菌基內(nèi)菌絲透明且較細(xì)，氣生菌絲顏色較暗，直徑較粗，呈淡青色。孢子絲波曲形，孢子絲成熟后形成的孢子鏈呈串珠狀，表面光滑（圖1C）。掃描電鏡下可見拮抗菌FQ-7產(chǎn)短棒狀分生孢子，表面光滑，分生孢子大小為（0.9～1.1）μm×（0.6～0.8）μm（長×寬）（圖1D）。

圖1 拮抗菌FQ-7的拮抗效果與形態(tài)特征

2.3 拮抗菌FQ-7培養(yǎng)特征

2.3.1 培養(yǎng)特征 拮抗菌FQ-7在供試的5種培養(yǎng)基上都能生長，其中，在燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長最好，其次是酵母精麥芽糖精瓊脂和無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基。該菌在馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基上生長最差，在5種供試培養(yǎng)基上形成不同特點(diǎn)的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，其可溶性色素的顏色也略有差異（表1）。

表1 拮抗菌FQ-7在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

2.3.2 菌株FQ-7的生理生化特性 該菌為兼性好氧型，接觸酶、甲基紅試驗(yàn)陰性，能分解淀粉與酪素，不耐鹽，在10 g/L時(shí)生長速度最快。該菌能利用葡萄糖、甘露醇、蔗糖和麥芽糖，不能利用乳糖、纖維二糖、山梨醇和甜醇。

2.4 拮抗菌FQ-7 16S rDNA分析

16S rDNA序列測序結(jié)果表明，F(xiàn)Q-7的16S rDNA序列長度為1 484 bp。將該序列在GenBank中進(jìn)行Blast檢索，發(fā)現(xiàn)菌株FQ-7與鏈霉菌屬（Strept omyces）菌株相似性最高，說明該菌株可能是鏈霉菌屬的成員。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖2）顯示，F(xiàn)Q-7與菌株Streptomyces violaceolatus（KT363060）聚在同一分支上，同源性在99%以上。結(jié)合菌株FQ-7的形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化試驗(yàn)鑒定和16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株FQ-7鑒定為紫邊鏈霉菌（Streptomyces violaceolatus），命名為Streptomyces violaceolatusFQ-7。

圖2 菌株FQ-7基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 發(fā)酵液活性物質(zhì)研究

2.5.1 熱穩(wěn)定性 由圖3可知，菌株FQ-7發(fā)酵液乙酸乙酯提取物經(jīng)100～121℃熱處理后，其抗菌活性均無顯著性差異。在40～121℃，隨著處理溫度的升高，抑菌圈直徑為7.8～8.3 mm，相對(duì)抑菌活性保持在88.51%～95.40%，說明FQ-7菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好。

圖3 溫度對(duì)菌株FQ-7抑菌活性的影響

2.5.2 酸堿穩(wěn)定性 由圖4可知，菌株FQ-7發(fā)酵液乙酸乙酯提取物抑菌活性在酸性和中性條件下比較穩(wěn)定，且隨著pH的升高，其抑制菌活性有逐漸下降的變化趨勢。在試驗(yàn)pH范圍內(nèi)（pH 2.0～8.0），其抑菌圈直徑為7.5～8.7 mm，相對(duì)抑菌活性保持在86.52%～99.88%，說明FQ-7菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有較好的酸堿穩(wěn)定性。

圖4 pH對(duì)菌株FQ-7抑菌活性的影響

2.5.3 紫外光穩(wěn)定性 由圖5可知，隨著紫外光照射時(shí)間的延長，菌株FQ-7發(fā)酵液乙酸乙酯提取物抑菌活性呈逐漸減弱的變化趨勢。照射30～120 min，其抑菌圈直徑為7.4～7.9 mm，相對(duì)抑菌活性保持在85.52%～91.05%，說明該菌株所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)紫外光照射的穩(wěn)定性較好。

圖5 紫外光對(duì)菌株FQ-7抑菌活性的影響

3 小結(jié)與討論

植物根系周圍分布有種類多樣的微生物，根際環(huán)境是植物微生物互作的區(qū)域，其中，根際放線菌可誘導(dǎo)植物抗病性，激發(fā)耐旱能力或作為生防制劑［15］。有文獻(xiàn)報(bào)道，這些放線菌可以通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、降解酶或揮發(fā)性物質(zhì)等途徑抑制植物病原菌的生長［16］。人類已發(fā)現(xiàn)的抗生素多數(shù)來源于放線菌，特別是鏈霉菌屬放線菌［13］。當(dāng)前，放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的一個(gè)重要方向就是從中發(fā)現(xiàn)一些有應(yīng)用潛力的農(nóng)用抗生素及其產(chǎn)生菌，用于植物病害的防治［17］。羅文建等［9］從鏈霉菌LC-7中分離到一種新的氨基糖苷類抗生素，對(duì)煙草青枯病有顯著的防治效果。Prabavathy等［18］研究Stre ptomycessp PM5對(duì)稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的防控作用，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生的2種脂肪族化合物有明顯效果。李慶蒙［19］研究指出，Stre ptomycesPM5對(duì)煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌和根霉等多種作物病原真菌具有生物活性，其抗菌物質(zhì)對(duì)熱處理、光照射及酸堿處理的穩(wěn)定性較好。

本研究對(duì)生防菌Streptomyces violaceolatusFQ-7進(jìn)行了形態(tài)培養(yǎng)特征觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列聚類分析，最終鑒定為紫邊鏈霉菌。紫邊鏈霉菌是土壤中常見類群［20，21］，但在生態(tài)系統(tǒng)中的功能了解較少。杜靜［22］應(yīng)用三重抗生素抗性篩選方法，從四川、湖北、山東、遼寧和黑龍江5省的土樣中分離得到4株鏈霉菌，其發(fā)酵粗提物對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌及9種植物病原真菌表現(xiàn)出不同程度的抑制活性。其中，49號(hào)菌株同Streptomyces violaceolatus的相似性為99%，其發(fā)酵液上清液和菌體浸提液對(duì)甜椒菌核病菌、水稻紋枯病菌和黃瓜黑星病菌3種病原真菌的菌絲生長抑制率均在90%以上，但其發(fā)酵粗提物對(duì)溫度的穩(wěn)定性較弱，當(dāng)溫度達(dá)30℃時(shí)，其抑菌活性完全喪失。Hayakawa等［23］發(fā)現(xiàn)Streptomyces violaceolatusA32產(chǎn)生的3種異硫脲抗生素對(duì)革蘭氏陽性菌有顯著的抑菌效果，但對(duì)革蘭氏陰性菌及真菌沒有生物活性。還有研究發(fā)現(xiàn)分類上與Streptomyces violaceolatus相近的菌株Streptomyces violaceolatusA3產(chǎn)生放線菌紫紅素（Actinorhodin）、次甲霉素（Methylenomycin）、十一烷基靈菌紅素（Undecylprodigiosin）和鈣依賴型抗生素［24］。Streptomyces violaceolatusFQ-7對(duì)營養(yǎng)和環(huán)境條件要求較低，分離簡便，抑菌活性物質(zhì)對(duì)熱、pH和紫外光照射穩(wěn)定性強(qiáng)，表明該菌在生防方面潛在的應(yīng)用價(jià)值，為青枯病菌的生物防治提供了新的微生物資源。