遼寧省玉竹根腐病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

李曉麗，孫文松，劉 瑩，李 玲，張?zhí)祆o

（遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼寧 遼陽 111000）

玉竹［PoLygonatum ordoratum（Mill.）Druce］為百合科（LiLiaceae）黃精屬，為多年生草本植物，以根莖入藥，具有養(yǎng)陰潤燥、生津止渴等功效［1］。玉竹在中國大部分地區(qū)均有分布，是東北地區(qū)重要的道地藥材之一。近年來，隨著藥用植物種植規(guī)模逐漸擴(kuò)大，可利用土地資源不斷減少，藥用植物輪作周期縮短，種植年限增加，病害逐漸加重。本研究針對遼寧省玉竹主產(chǎn)區(qū)根腐病發(fā)生問題，采集病株并進(jìn)行病原菌分離鑒定，旨在明確玉竹根腐病病原菌的種類及其生物學(xué)特性，為有效防控玉竹根腐病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病株采自遼寧省撫順市清原縣，具有玉竹根腐病典型特征。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

1）病原菌分離培養(yǎng)與純化。采用組織分離法分離病原菌。根莖表面消毒參照Li等［2］的方法并進(jìn)行了一些改進(jìn)，將采集的病害根部沖洗干凈，從病健組織交界處切取1 cm長的根莖組織，70%乙醇消毒30 s后轉(zhuǎn)入3%次氯酸鈉溶液中消毒3 min，無菌水清洗3次后，放在無菌濾紙上吸干殘余水分，將消毒后的根部剖開，剖面朝下置于察氏培養(yǎng)基中央，25℃黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后，采用單孢分離法獲得純培養(yǎng)。

2）病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。觀察病原菌菌落的形狀、顏色等特征，并在顯微鏡下觀察病菌子實(shí)體形態(tài)并測量。

3）病原菌分子生物學(xué)鑒定。將活化后的病原菌接種于PD液體培養(yǎng)基，置于25℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床培養(yǎng)5 d，離心收集菌體，采用Cenis方法提取總DNA，以其為模板，應(yīng)用真菌通用引物EF1（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′）和EF2（5′-GGAAG TACCAGTGATCATGTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［3］，擴(kuò)增產(chǎn)物委托北京鼎國生物工程技術(shù)公司測序。將所獲得的拮抗菌株EF序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進(jìn)行比對，并用DNAStar構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行多序列同源性分析。

1.2.2 致病性測定

1）接種物準(zhǔn)備。將供試菌株移植于PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm菌餅5片，移入裝有100 mL PD液培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床120 r/min，25℃振蕩培養(yǎng)7 d，然后用無菌水將培養(yǎng)液稀釋成濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液，備用。

2）盆栽接種。根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行測定。將每1 kg滅菌土與200 mL（1×105個孢子/mL）孢子懸浮液充分混合，裝入花盆中。取健康玉竹植株，將根莖用清水洗凈，吸干表面水分，劃傷根莖表皮，浸入菌液中0.5 h，移栽至花盆。用PD液培養(yǎng)基代替孢子懸浮液與等量滅菌土混合裝入同體積花盆，以栽種劃傷不接種的根莖為對照。每盆栽種3株，4次重復(fù)。

1.2.3 病原菌生物學(xué)特性研究

將在PDA平板上培養(yǎng)5 d的供試菌株，用直徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣切取菌絲圓片，置于不同的條件下培養(yǎng)，研究其生物學(xué)特性。

1）最佳培養(yǎng)基。供試7種培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、察氏培養(yǎng)基（CA）、水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、改良馬丁氏培養(yǎng)基（MA）、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）、胡蘿卜培養(yǎng)基（HLB）。每個處理3次重復(fù)，置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測量菌落生長直徑。

2）最佳碳源。以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加等量葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖，代替查氏培養(yǎng)基中的碳源，配制成不同碳源培養(yǎng)基，以不加碳源的察氏培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件及測定方法同上。

3）最適氮源。以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加等量硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素、牛肉膏，代替察氏培養(yǎng)基中的氮源，配制不同氮源培養(yǎng)基，以不加氮源的察氏培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)條件及測定方法同上。

4）最適宜pH。用HCl（1 mol/L）和NaOH（1 mol/L）無菌水溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH至4、5、6、7、8、9、10、11共8個梯度，檢測酸堿度對菌株生長的影響。

5）適宜溫度。采用PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為5～40℃，梯度為5℃，在不同溫度條件下培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測量菌落生長直徑。

6）適宜光照。采用PDA培養(yǎng)基，分別置于24 h黑暗、24 h光照、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測量菌落生長直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

從玉竹病根中分離得到根腐病菌菌株，該菌株菌落圓形，突起絮狀，初期白色，后逐漸變?yōu)闇\粉色，菌絲體白色致密，大型分生孢子無色，鐮刀形，略彎曲，多數(shù)為3隔，長度為8～16μm，小型分生孢子無色，單胞，卵圓形。其形態(tài)特征同董鮮等［4］報(bào)道的尖孢鐮孢菌相似，從形態(tài)學(xué)上證明該病原菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

以純化后的病原菌YZGF-21為材料，利用EF1和EF2引物［5］對病原菌延長因子進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條約600 bp的片段。通過測序獲得片段長度為547 bp，在GenBank上進(jìn)行Blast比對，顯示與該序列同源性較高（95%以上）的序列均為尖孢鐮孢菌，從中選取5株相似率最高的序列，再選取鐮孢菌屬芬芳鐮孢菌（Fusarium redolens）、茄鐮孢菌（Fusarium solani）、銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）等病原菌序列，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示，菌株YZGF-21與尖孢鐮孢菌（MN417151、MN417190、MN417191和MN417192）聚為一支，同源性較高，相似性達(dá)100%；菌株YZGF-21與芬芳鐮孢菌、茄鐮孢菌、銳頂鐮孢菌聚為不同分支。綜上所述，結(jié)合形態(tài)學(xué)、病菌生物學(xué)特性及分子鑒定，將菌株YZGF-21確定為尖孢鐮孢菌。

圖1 菌株YZGF-21序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 致病性測定

接種后觀察致病性的測定結(jié)果，接種8 d根莖上出現(xiàn)褐色小病斑，接種20 d病斑逐漸擴(kuò)大，腐爛程度加重，葉片逐漸黃化枯死，植株倒伏。從發(fā)病根莖上重新分離的病原菌與接種病原菌相同。

2.4 生物學(xué)特性測定

2.4.1 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響 由表1可見，病原菌在7種培養(yǎng)基上均能生長，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上生長速度最快，培養(yǎng)7 d后菌落直徑可達(dá)71.8 mm，顯著高于水瓊脂培養(yǎng)基和玉米粉培養(yǎng)基。其次是馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、改良馬丁氏培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基。可見馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基最適合該病原菌生長。

表1 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響

2.4.2 不同碳源對病原菌生長的影響 由表2可見，病原菌在5種碳源培養(yǎng)基和無碳察氏培養(yǎng)基（CK）中均可生長且差異不顯著，在甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)7 d菌落直徑可達(dá)75.1 mm，生長速度表現(xiàn)為甘露醇＞葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞蔗糖＞對照（CK）。因此，適宜病原菌生長的碳源為甘露醇，其次為葡萄糖。

表2 不同碳源對病原菌生長的影響

2.4.3 不同氮源對病原菌生長的影響 由表3可見，病原菌在6種氮源培養(yǎng)基和無氮察氏培養(yǎng)基（CK）中均可生長，在硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)7 d后菌落直徑可達(dá)73.4 mm，與硝酸鈉和牛肉膏氮源差異不顯著，同其他氮源差異顯著。6種氮源均顯著高于CK?？梢?，適宜病原菌生長的氮源為硝酸鉀，其次為硝酸鈉和牛肉膏。

表3 不同氮源對病原菌生長的影響

2.4.4 pH對病原菌生長的影響 由圖2可見，病原菌在pH為4～11時均可生長。在pH為6時生長最快，其次是pH為7和5時，三者之間差異不顯著，菌落直徑分別為79.5、78.8、72.4 mm。其余菌落直徑由大到小依次是pH 8、9、4、10、11?？梢?，pH為5～7適宜該病原菌生長，最適pH為6。

圖2 pH對病原菌生長的影響

2.4.5 不同溫度對病原菌生長的影響 由圖3可見，病原菌在10、15、20、25、30、35℃時均能生長，在5℃和40℃時無法生長，生長速度以25℃最快，菌落直徑為79.5 mm，與30℃差異不顯著，與其他處理間差異顯著。其余菌落生長速度由大到小依次是20、15、35、10℃，相互間差異顯著?？梢?，25～30℃適宜該病原菌生長，最適生長溫度為25℃。

圖3 不同溫度對病原菌生長的影響

2.4.6 光照對病原菌生長的影響 由圖4可見，病原菌在3種光照條件下均可生長，完全黑暗條件下生長最快，三者之間差異不顯著。由此可見，光照對菌株生長的影響很小，最適生長的條件為完全黑暗。

圖4 光照對病原菌生長的影響

3 小結(jié)與討論

鐮孢菌（Fusariumspp.）是一類在世界范圍內(nèi)廣泛分布的土傳病原真菌，約50%的鐮孢菌植物病害由茄鐮孢菌引起；其次為尖孢鐮孢菌（約20%）引起，該菌寄主植物分布廣泛，可引起西瓜、香莢蘭、亞麻、黃芪、番茄、黃瓜、發(fā)財(cái)樹、棉花等［5-12］多種植物發(fā)病。關(guān)于玉竹根腐病病原菌的鑒定，崔蕾等［13］鑒定湖南省新邵縣玉竹為茄鐮孢菌。吳金平等［14］鑒定湖北省玉竹為尖孢鐮孢菌和煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）2種致病菌復(fù)合侵染；畢武等［15］研究表明湖南省邵東市玉竹根腐病的主要病原為芬芳鐮孢菌。本研究鑒定來自遼寧省撫順市清原縣的玉竹根腐病病原菌為尖孢鐮孢菌。可見，不同地區(qū)引起玉竹根腐病的病原菌種類有所不同。有關(guān)尖孢鐮孢菌引起玉竹根腐病在南方玉竹產(chǎn)區(qū)已有報(bào)道，而在北方地區(qū)尚屬首次。

尖孢鐮孢菌生物學(xué)特性在其他植物上的研究報(bào)道較多，但不同地區(qū)、不同寄主的病原菌菌株生物學(xué)特性存在一定差異。香莢蘭尖孢鐮孢菌的最適生長溫度為28℃，最適pH為6.5［6］。三七根腐病尖孢鐮孢菌孢子最適萌發(fā)溫度為30℃，pH為6，碳源為乳糖或淀粉，氮源為硝酸銨［16］。苜蓿根腐病尖孢鐮孢菌適宜生長溫度為20～30℃，pH為7～8，黑暗條件適宜生長，適宜培養(yǎng)基有PSA、SNA、YMM，最適碳源分別為可溶性淀粉和麥芽糖，最適氮源分別為尿素和蛋白胨［17］。建蘭莖腐病尖孢鐮孢菌生長及產(chǎn)孢最適溫度為25℃，pH為7，光照條件為12 h光暗交替，碳源為α-乳糖，氮源為NaNO2［18］。本研究結(jié)果表明，該病原菌生長最適宜的培養(yǎng)基為PDA，碳源為甘露醇，氮源為硝酸鉀，溫度為25～30℃，pH為5～7，光照條件為完全黑暗。這說明尖孢鐮孢菌在不同的寄主中生長的最適溫度、pH、光照條件、碳源、氮源等有所差異。

本研究通過病菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合技術(shù)，確定了中國北方玉竹根腐病種類，明確了玉竹根腐病病原菌生物學(xué)特性，闡明病菌生長與環(huán)境條件的關(guān)系，為玉竹根腐病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。