臺灣相思甲醇提取物抑菌活性研究

龐皓元

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 530021）

有害微生物對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康造成嚴(yán)重危害，植物病原真菌引起的真菌病害是植物病害中最大的一類，每年給農(nóng)作物造成重大損失。長期以來，采用化學(xué)農(nóng)藥如多菌靈、甲基托布津等來控制真菌病害，但化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留容易損害人類健康。細(xì)菌感染同樣也是人類常見的病因之一?？咕睾突前奉愃幬锍霈F(xiàn)后，細(xì)菌感染得到有效控制，直至今日仍被廣泛應(yīng)用，但抗菌素及磺胺類藥的濫用帶來了諸多問題，如毒性反應(yīng)、二重感染、細(xì)菌耐藥性以及藥物有害殘留等。從植物中尋找抗菌活性物質(zhì)，進(jìn)一步開發(fā)為植物源殺菌劑及抗菌新藥是解決上述問題的一條重要途徑［1，2］。

臺灣相思（AcaciaconfusaMerr.）為含羞草科（Mimosaceae）金合歡屬植物，別名相思樹、臺灣柳、相思仔，為常綠喬木，高6～15 m，苗期第一片真葉為羽狀復(fù)葉，長大后小葉退化，葉柄變?yōu)槿~狀柄，長6～10 cm，寬5～13 mm，主要分布于中國臺灣、福建、云南及兩廣等地，印度尼西亞、斐濟(jì)、菲律賓也有分布［3］。臺灣相思生長迅速，耐干旱，是華南地區(qū)荒山造林、水土保持和沿海防護(hù)林的重要樹種［3］。其木材材質(zhì)堅硬，可用來做家具、車輪、槳櫓等，因此，目前對臺灣相思的研究多集中在植樹造林及材質(zhì)的研究上，也有文獻(xiàn)報道其酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性及抗肝炎病毒活性［4-8］，而其抑菌活性鮮見報道。本研究旨在明確臺灣相思甲醇提取物的抑菌活性，為其進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料及試劑 臺灣相思葉狀柄（廣西北海市采集）；甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、馬鈴薯、NaOH（專用調(diào)pH）、消毒乙醇、去離子水等。

1.1.2 儀器 恒溫鼓風(fēng)干燥箱、植物粉碎機(jī)、超聲波清洗器、真空抽濾泵、高壓蒸汽滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超凈工作臺、電子天平、移液槍、移液管、打孔器、接種環(huán)、涂棒、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.3 供試病原菌 如表1所示，共11種植物病原真菌，其中，9種由廣西大學(xué)提供，金桔砂皮病菌和柑橘鏈格孢菌由廣西桂林市柑橘研究所提供，并用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)菌培養(yǎng)后于冰箱中4℃保存?zhèn)溆茫?4種動物病原菌由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，并用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)菌培養(yǎng)后于冰箱中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試病原菌種類

1.2 方法

1.2.1 植物成分的提取 植物材料用恒溫鼓風(fēng)干燥箱60℃烘干至發(fā)脆，用植物粉碎機(jī)粉碎。干粉按1∶5的比例加入甲醇，超聲輔助提取30 min（頻率45 kHz，100 W）［9，10］，抽濾，濾液50℃減壓濃縮，得到膏狀提取物。置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

1）PDA培養(yǎng)基的制備。PDA培養(yǎng)基用于真菌的培養(yǎng)，配方為馬鈴薯200 g，瓊脂17～20 g，蔗糖20 g，去離子水1 000 mL。將去皮馬鈴薯切成小塊，加入1 000 mL去離子水加熱煮沸30 min后用4層紗布過濾，補(bǔ)充去離子水至1 000 mL，再煮，加瓊脂15～17 g，再加蔗糖20 g，煮沸即可，將配制好的培養(yǎng)基置于121℃高壓蒸汽滅菌30 min，取出，晾涼，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)，配方為蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂17～20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。準(zhǔn)確稱取各成分，將除瓊脂粉外的成分先倒入沸水中，最后加入瓊脂粉，用玻璃棒攪拌溶液混均后停止加熱，用NaOH調(diào)至所需pH。將配制好的培養(yǎng)基置于121℃高壓蒸汽滅菌30 min，取出，晾涼，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對植物病原真菌的抑菌活性測定 將臺灣相思甲醇提取物干膏用丙酮和去離子水按1∶1超聲溶解，配制成100 g/L溶液，在超凈工作臺無菌條件下，用移液槍吸取1 mL藥液與9 mL熱的PDA培養(yǎng)基在直徑9 cm培養(yǎng)皿中混合均勻制成10 g/L的帶毒培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，用直徑4 mm的打孔器在培養(yǎng)好的供試真菌菌落邊緣切取菌餅，用接種針將菌餅接在帶毒培養(yǎng)基表面，使帶菌絲的一面朝下，每皿接3個菌餅［11］。設(shè)置對照組（CK，丙酮與去離子水1∶1混合）。置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h觀察菌絲生長情況。

經(jīng)過如上試菌試驗(yàn)，初步了解粗提物在10 g/L的濃度時對辣椒炭疽病菌、茶輪斑病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、金桔砂皮病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、柑橘鏈格孢菌有一定的抑菌效果，對花生冠腐病菌、煙草黑脛病菌的抑菌效果不明顯，對水稻胡麻葉斑病菌具有促進(jìn)生長作用。將帶毒培養(yǎng)基濃度降低為10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 g/L進(jìn)行試驗(yàn)，采用生長速率法測定臺灣相思的抑菌活性；對花生冠腐病菌、煙草黑脛病菌和水稻胡麻葉斑病菌將濃度提高到20.0 g/L。在菌落長到最大時（再繼續(xù)長菌落就會重合），用十字交叉法測量菌落直徑，并按此式計算抑菌率：抑菌率=［（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）］/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.2.4 對動物病原菌的抑菌活性測定 用丙酮和去離子水按1∶1混合超聲溶解臺灣相思甲醇提取物干膏，配制成100 g/L溶液，在超凈工作臺無菌條件下，用移液槍吸取1 mL藥液與9 mL熱的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中混合均勻制成10 g/L的帶毒培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取稀釋后的菌懸液0.1 mL，滴到培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂布均勻。設(shè)置對照組。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h觀察菌落生長情況。

經(jīng)過觀察，初步了解到提取物在10 g/L濃度時對傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，對產(chǎn)氣腸桿菌、乙型副傷寒桿菌、炭疽桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌則無明顯抑菌效果。采用液體培養(yǎng)基稀釋法測定對細(xì)菌的抑菌活性［11］，將0.05 mL菌懸液與0.95 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基混合制成帶菌培養(yǎng)基，將藥液配制成100、50、10、5、1 g/L，再用移液槍吸取0.1 mL與0.9 mL帶菌培養(yǎng)基混合，這樣藥液的濃度稀釋了10倍。分別于24、48 h后觀察液體培養(yǎng)基的澄清渾濁情況，并記錄，再縮小濃度范圍重復(fù)試驗(yàn)。對產(chǎn)氣腸桿菌、乙型副傷寒桿菌、炭疽桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌采用濾紙片法［11］，用打孔器將濾紙打成6 mm的圓片，滅菌，置于100 g/L的藥液中浸泡幾分鐘，夾出自然晾干，貼到已涂布細(xì)菌的培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿放4片濾紙，在中間放置對照（CK）濾紙，24、48 h后觀察有無抑菌圈，并用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5 提取物的初步分離 用液-液萃取法對臺灣相思提取物進(jìn)行初步分離。提取物用去離子水超聲波輔助溶解。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按1∶1萃取，最后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，石油醚層和乙酸乙酯層用40℃水浴減壓蒸發(fā)濃縮，正丁醇層和水層用80℃水浴減壓蒸發(fā)濃縮。將所得每層蒸膏分別進(jìn)行病菌抑菌效果測定。真菌用生長速率法測定，培養(yǎng)于5.0 g/L的帶毒培養(yǎng)基上；細(xì)菌用10.0 g/L的濾紙片進(jìn)行測定。真菌和細(xì)菌的藥液濃度不同主要由藥液對其的抑菌活性以及各萃取層溶解難易程度決定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臺灣相思提取物對植物病原真菌的抑菌活性

由試驗(yàn)結(jié)果（表2、表3）來看，在供試的11種病原真菌中，在低濃度藥液下對玉米大斑病菌和玉米小斑病菌等幾種菌有促進(jìn)生長作用，而在臺灣相思甲醇提取物濃度為10.0 g/L時，對8種菌有抑菌效果，其中，抑菌率達(dá)50%以上的有5種（包括金桔砂皮病菌）。將臺灣相思甲醇提取物濃度提高到20.0 g/L時，對原來沒抑制效果和有促進(jìn)生長作用的煙草黑脛病菌、水稻胡麻葉斑病菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制效果。而對于花生冠腐病菌，對其孢子有一定的抑制效果，但對于其菌絲的生長沒有抑制作用。表明臺灣相思甲醇提取物對真菌具有較廣譜的抑菌活性，且對某些真菌，如甘藍(lán)黑斑病菌在10.0 g/L（相當(dāng)于0.042 g DW/mL）的濃度下有較強(qiáng)烈的抑制作用。蔣紅云等［12］研究的96種植物甲醇提取物在0.05 g DW/mL時，對玉米大斑病菌抑制率在80%以上的植物有21種，對玉米小斑病菌抑制率在50%以上的植物有50種。而丘麒等［13］研究表明21種植物甲醇提取物在10 mg DW/mL時，對甘蔗鳳梨病菌的抑菌率超過22.76%的有8種，而本研究中臺灣相思在此抑菌率時的濃度為1.0 g/L（相當(dāng)于4.2 mg DW/mL），可見臺灣相思對真菌抑菌作用較強(qiáng)。

表2 臺灣相思甲醇提取物不同濃度對幾種真菌的抑制活性

表3 臺灣相思甲醇提取物濃度為20.0 g/L對其10.0 g/L不能抑制的3種真菌的抑制效果

2.2 臺灣相思提取物對動物病原細(xì)菌的抑菌活性

由表4、表5可知，在臺灣相思甲醇提取物濃度為10.0 g/L的條件下，24、48 h內(nèi)，臺灣相思對9種病原細(xì)菌有抑制活性，其中，對蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌的抑制效果最強(qiáng)，在1.0 g/L濃度下就達(dá)到抑制效果，而對傷寒沙門氏菌則要10.0 g/L的濃度才能抑制。將濃度增加到100 g/L，對原10 g/L濃度時沒有抑制效果的綠膿桿菌、大腸桿菌、乙型副傷寒桿菌也產(chǎn)生了抑菌效果，但對產(chǎn)氣腸桿菌和炭疽桿菌仍然沒有抑制效果。表明臺灣相思對病原細(xì)菌同樣具有較強(qiáng)的抑制活性。

表4 臺灣相思甲醇提取物不同濃度對幾種細(xì)菌的抑制活性

2.3 提取物各萃取層對病原真菌的抑菌活性

由表6可以看出，對8種病原真菌的有效成分主要集中在正丁醇層，在5 g/L的濃度下，除柑橘鏈格孢菌之外，抑菌效果均在80%以上。此外，乙酸乙酯層對甘蔗鳳梨病菌也有較強(qiáng)的抑菌活性，對玉米大斑病菌的抑菌率也超過了50%；水層對玉米大斑病菌和甘藍(lán)黑斑病菌有較好的抑菌效果。在粗提物抑菌試驗(yàn)中低濃度促進(jìn)玉米小斑病菌菌絲生長的可能原因是石油醚層和乙酸乙酯層中低極性有機(jī)物有利于其生長；而促進(jìn)玉米大斑病菌生長可能是有效成分結(jié)合在一起，降低了活性，反而利于真菌的生長。

表6 臺灣相思提取物不同萃取層5 g/L濃度時對幾種真菌的抑制效果

2.4 提取物各萃取層對病原細(xì)菌的抑菌活性

由表7可以看出，對細(xì)菌的有效成分主要分布在乙酸乙酯層，但不是對所有的細(xì)菌都一樣。對溶壁微球菌和巨大芽孢桿菌的有效成分在正丁醇層和水層。但總的來說雖然對每種菌都產(chǎn)生了抑菌圈，但大部分細(xì)菌能在抑菌圈內(nèi)生長少量細(xì)菌，說明抑菌不完全，但對在低濃度的粗提物就有很好抑制效果的蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和痢疾志賀氏菌在乙酸乙酯層的藥液有較大的抑菌圈且抑菌圈內(nèi)不生長細(xì)菌，說明臺灣相思對這些細(xì)菌的抑制效果好。

表7 臺灣相思提取物不同萃取層10 g/L濃度時對細(xì)菌的抑制效果

3 小結(jié)與討論

本研究摘取臺灣相思的葉狀葉柄曬干打粉，用甲醇超聲波輔助提取30 min，50℃水浴旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)濃縮得到蒸膏，干膏率為23.8%。研究蒸膏配制藥液對病原菌的活性。結(jié)果表明，臺灣相思甲醇提取物對病原真菌和細(xì)菌均具有廣譜的抑菌活性，且活性較高。在臺灣相思提取物10.0 g/L濃度下對11種供試真菌中的8種有活性，其中，5種的抑菌率達(dá)50%以上，5種中有3種達(dá)90%以上。同樣，在10.0 g/L濃度下對14種供試細(xì)菌中，對9種有活性，其中3種細(xì)菌在1.0 g/L濃度下就有很好的抑菌效果，遠(yuǎn)高于其他植物提取物的抑菌效果。在液-液萃取分離試驗(yàn)中，各萃取層萃取的物質(zhì)所占的比例分別為石油醚層18%、乙酸乙酯層17%、正丁醇層32%、水層27%。對病原真菌的抑制活性物質(zhì)主要存在于正丁醇層，在5 g/L濃度下對7種真菌的抑菌率在80%以上；而對病原細(xì)菌的抑制活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯層，但對于個別細(xì)菌，活性物質(zhì)存在于正丁醇層和水層。

從植物中尋找殺菌抑菌活性物質(zhì)是開發(fā)無公害新型殺菌劑的有效途徑之一。物競天擇，適者生存是自然界的法則，生物在進(jìn)化的過程中有相互促進(jìn)也有相互抑制，在自然界暴發(fā)的病害也可以在自然界中找到抑制其的物質(zhì)。中草藥是前人在自然中對抗疾病所積累的經(jīng)驗(yàn)植物，目前尋找殺菌抑菌活性物質(zhì)的研究也多集中在中草藥。但在新的時代，細(xì)菌不斷變異進(jìn)化，必須不斷開發(fā)新的植物以填補(bǔ)中草藥的空缺。臺灣相思分布在中國東南部，作為景觀樹和防護(hù)林種植，有一定的資源量。本研究初步研究了其抑菌活性，還有待更深入地研究其活性物質(zhì)，以豐富植物源藥的種類。