檸檬酸提取法時間對海帶多糖提取率的影響及其穩(wěn)定性研究

熊江燕 王琤韋華

(江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013)

海帶是海洋中的一種經(jīng)濟價值和產(chǎn)量極高的大型褐藻，其含有多種結(jié)構(gòu)不同、性質(zhì)迥異的天然活性多糖成分。 其中海帶多糖具有降血脂、 抗氧化、防輻射及調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，并在動物養(yǎng)殖方面實現(xiàn)了基于海帶多糖等海帶活性物質(zhì)的新型飼料添加劑研發(fā)， 其在畜牧業(yè)的應(yīng)用價值和經(jīng)濟效益不斷提升。 但商品海帶普遍成本高且生產(chǎn)工藝繁瑣，因此，如何在低成本的基礎(chǔ)上高效地提取出海帶多糖就成為了畜牧業(yè)的一個研究熱點。目前，采用熱水浸提法、酸提取法、堿提取法和酶解法提取海帶多糖的報道較多。 其中酸提取法是一種工藝簡單，成本較低，而提取率又較高的海帶粗多糖的提取方法。但海帶的干燥方法、海帶目數(shù)、提取溫度、浸提液pH、提取時間及料液比等因素都會影響多糖的提取量。 本試驗研究時間這一因素對檸檬酸提取海帶多糖的影響， 并在此基礎(chǔ)上比較海帶多糖在強酸強堿溶液中的穩(wěn)定性，為推動其在動物生產(chǎn)實踐上的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 試驗材料

干海帶購于江西科技師范大學(xué)附近市場。

1.1.2 試驗試劑

檸檬酸；葡萄糖；濃硫酸；氫氧化鈉；無水乙醇；苯酚；三氟乙酸，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗儀器

電子天平(FA-1004)，上海力辰邦西儀器科技有限公司；恒溫水浴鍋(SYG-4)，上海助藍科技有限公司；鼓風恒溫干燥箱(101-2B)，唯恒機械設(shè)備有限公司；高速離心機(HC-2062)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司； 可見分光光度計(UV-722)，上海佑科儀器儀表有限公司；予華牌循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ)，長沙明杰儀器有限公司；移液槍(M-1000)，寧波市群安實驗儀器有限公司。

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

分 別 取 0.00、 0.20、 0.40、 0.60、 0.80、1.00mL 100mg/L 標準葡萄糖溶液于試管中，用蒸餾水將其補至1.00mL。 分別向各試管中加入1.00mL 5%苯酚溶液、5.00mL 濃硫酸溶液， 混勻。先靜置5min，后沸水浴反應(yīng)15min，冷卻后490nm測量各試管中溶液的吸光值。 最后繪制葡萄糖標準曲線，每組葡萄糖的質(zhì)量濃度作為橫坐標，相應(yīng)的OD 值為縱坐標。

1.2.2 海帶多糖提取工藝流程

干海帶進行粉碎，pH=2 的檸檬酸溶液與海帶粉末按液料比40：1(mL/g)在100℃水浴中分別浸提1h、2h、3h、4h、5h， 浸提液用6 層紗布過濾，5000r/min 離心10min， 取上清液加入氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH 為中性，濃縮，分3 次醇沉(乙醇最終濃度為80%)，醇沉后進行抽濾得沉淀，洗滌脫水后用恒溫鼓風干燥箱烘干得海帶粗多糖。

1.2.3 穩(wěn)定性試驗

稱取0.2000g 左右海帶粗多糖， 分別加入5.00mL 4mol/L 的三氟乙酸、氫氧化鉀溶液，一組加入5.00mL 蒸餾水作為對照組。 三組混合液于60℃保溫6h， 冷卻后將pH 調(diào)至中性并定容至10.00mL。 取1mL 混合液， 向各試管中 加入1.00mL 5%苯酚溶液、5.00mL 濃硫酸溶液， 混勻。首先室溫靜置5min，然后沸水浴反應(yīng)15min，冷卻后用可見分光光度計在490nm 測得OD 值。

1.3.1 提取率

烘干后的粗多糖用蒸餾水進行溶解并稀釋一定倍數(shù)， 后參考文獻采用苯酚-硫酸法在490nm下測定吸光度， 所得吸光度值代入葡萄糖標準曲線計算多糖含量再根據(jù)以下公式計算提取率：

提取率=浸提液中多糖含量/所用干海帶粉末的質(zhì)量*100%

1.3.2 穩(wěn)定性

將經(jīng)酸堿處理后的溶液及對照組測定吸光度，將吸光度值代入葡萄糖標準曲線計算多糖含量：

穩(wěn)定率=處理后多糖含量/未處理多糖含量*100%

使用Excel 對所有數(shù)據(jù)進行初步處理。

2 結(jié)果與分析

檸檬酸在不同的浸提時間下， 海帶多糖的提取率如表1 所示。由圖1 可知，海帶多糖的提取率隨著浸提時間的增長，呈先上升再下降的趨勢。當提取時間為4h 時， 多糖得率最高， 達到了39.05%，而超過4h 后，多糖得率開始降低，表明檸檬酸提取海帶多糖的最佳浸提時間為4h。

表1 海帶多糖的提取率

圖1 檸檬酸浸提不同時間的海帶多糖得率

在強酸與強堿溶液中海帶多糖的穩(wěn)定性如表2 所示。 由表2 可知， 與在水溶液中的對照組相比，海帶多糖在強酸性溶液中，穩(wěn)定性較好，穩(wěn)定率為88.51%，而在強堿性溶液中，海帶多糖的穩(wěn)定性較差，穩(wěn)定率為52.57%，表明海帶多糖的酸穩(wěn)定性顯著高于堿穩(wěn)定性。

表2 海帶多糖的穩(wěn)定性

3 討論

酸提法是一種傳統(tǒng)的提取海帶多糖的方式，酸提取法的原理是通過酸液的作用， 使海帶細胞壁充分膨大破裂，進而使海帶多糖游離出來。周裔彬等實驗在提取海帶多糖的傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了通過適當增加料液比、 提高浸提的溫度或合理延長浸提的時間而將檸檬酸溶液的作用發(fā)揮得更充分， 使其細胞壁充分吸水膨脹以致破裂的一種酸提法的優(yōu)化方式， 這樣可以使海帶多糖類化合物充分游離出來，達到純化及提高提取率的目的，提取率最高可達35.10%。 王智榮等用檸檬酸提取海帶多糖，通過單因素試驗及正交試驗，表明顯著影響海帶多糖得率的因素大小依次為：pH ﹥提取液料比﹥提取時間﹥提取溫度。 本試驗研究結(jié)果表明， 檸檬酸提取海帶多糖的最佳浸提時間是4h，在此條件下多糖得率是39.05%。 這可能是由于酸提取法可以有效防止褐藻膠溶出， 使浸提液中有較高的褐藻糖膠含量； 且由多糖的特性即它的粘度可以看出，酸提法的粘度遠小于水提法，說明酸提取法引起多糖分子的部分降解，4h 時海帶中的多糖基本上全部溶出， 繼續(xù)增加提取時間會破壞多糖結(jié)構(gòu)。試驗數(shù)據(jù)顯示，在3-4h 內(nèi)，海帶多糖提取率變化較小， 因而從成本、 環(huán)保節(jié)能的角度出發(fā)，提取時間應(yīng)控制在3h 與4h 之間。

目前，研究發(fā)現(xiàn)海帶中主要存在褐藻膠、褐藻糖膠、褐藻淀粉這三種多糖。由于海帶多糖是高度聚合的天然高分子化合物， 而褐藻膠分子是線性聚合物，其聚合度越高相應(yīng)的分子鏈也越長，粘度也就越高，屬于典型的膠體。粘性大并有良好的成膜性質(zhì)使其可以起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用， 因而海帶多糖在新型飼料添加劑的研發(fā)方面具有廣闊前景。但由于外界條件或產(chǎn)品質(zhì)量的影響，褐藻膠的線性分子會發(fā)生自然解聚的現(xiàn)象， 造成分子鏈逐漸斷裂使粘度降低， 通常粘度下降率越小表示其穩(wěn)定性越好。試驗證明，褐藻膠溶液的粘度及其穩(wěn)定性在pH 值維持在4～10 范圍內(nèi)基本不受pH 的影響， 特別是溶液為中性時褐藻膠的粘度可保持較穩(wěn)定的狀態(tài)。 其原理是分子結(jié)構(gòu)的羧基會產(chǎn)生排斥作用，導(dǎo)致羥基所存在的分子鏈延長，從而增強了它與水的相互結(jié)合，保持一定的穩(wěn)定狀態(tài)。在褐藻膠的制造工藝中中和褐藻酸時因用堿量不足或過多(pH 值降低或增高)使溶液未完全中和等原因，均會產(chǎn)生游離堿和褐藻酸。若溶液中存在處于游離狀態(tài)的褐藻酸， 褐藻酸的酸性會使它的水解先于中性鹽；而當溶液偏堿性時(此時pH 值大于10)也會促使褐藻膠的降解。 本試驗結(jié)果表明，海帶粗多糖在強酸溶液中的穩(wěn)定性為88.51%，顯著高于在強堿溶液中的穩(wěn)定性。 何粉霞等研究也表明海帶多糖在極端酸性條件下穩(wěn)定率在95%左右，在極端堿性條件下穩(wěn)定率會下降。

4 結(jié)論

本試驗研究表明， 檸檬酸的浸提時間會顯著影響海帶多糖得率， 且海帶粗多糖在強酸溶液中的穩(wěn)定性高于在強堿溶液中的穩(wěn)定性。因此，為降低動物養(yǎng)殖成本， 檸檬酸提取法用于工業(yè)生產(chǎn)海帶粗多糖時浸提時間不宜過長， 且作為一種理想的飼料添加劑， 其良好的化學(xué)穩(wěn)定性也有利于保持抗腫瘤、降血脂、提高免疫力及作為精液冷凍劑等生理功能。

參考文獻(略)