長鏈非編碼RNA LINC00261 在結直腸癌中的表達及其臨床意義

李敏，李忠信，楊會舉#

1 河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院肛腸科，鄭州450000

2 漯河市臨潁縣第二人民醫(yī)院肛腸科，河南 漯河4620000

結直腸癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢。結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，目前尚不清楚其發(fā)病機制。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉錄體長度大于200 nt 的RNA，不編碼任何蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在細胞周期調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控、轉錄后調(diào)控等生物學過程中發(fā)揮著重要作用，尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。LINC00261 是一個位于20p11.21 上的基因間lncRNA，LINC00261在多種腫瘤中起著促癌基因的作用。Fan 等發(fā)現(xiàn)LINC00261 在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，并能上調(diào)Slug 蛋白的表達，從而促進胃癌細胞上皮-間充質(zhì)轉化進程。抑制LINC00261 表達可促進結直腸癌細胞凋亡，并增加對化療藥物順鉑的敏感性。然而，目前尚不清楚LINC00261在結直腸癌中的作用，因此本研究擬探討lncRNA LINC00261 在結直腸癌中的表達及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017 年7 月至2020 年7 月于河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院接受手術切除術的86 例結直腸癌患者。納入標準：均經(jīng)病理組織學診斷為結直腸癌。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②術前已接受過放療、化療等其他治療干預。86 例結直腸癌患者中，男47 例，女39 例；年齡35～75 歲，平均（58.26±11.63）歲；根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）組織學標準，低分化31 例，中分化42 例，高分化13 例；美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM 分期：Ⅰ期18 例，Ⅱ期44例，Ⅲ期24 例。收集86 例結直腸癌患者術中留取的結直腸癌組織及癌旁組織石蠟標本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 原位雜交技術檢測結直腸癌組織及癌旁組織中LINC00261 的表達

按照原位雜交試劑盒（購自武漢博斯特有限公司）說明書進行操作，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合，用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水沖洗3 次，每次5 分鐘，然后在室溫下用3%過氧化氫處理10 分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，用DEPC 水沖洗3 次，逐滴添加30 μl 用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37 ℃孵育20 分鐘，DEPC 水沖洗3次，1%多聚甲醛室溫下固定10 分鐘，DEPC 水沖洗3 次，然后將20 μl 預雜交溶液逐滴添加到每個切片中，并在37 ℃孵箱中進行預雜交，2～4 小時后添加20 μl 探針雜交溶液（購自武漢博斯特有限公司），37 ℃孵育過夜。次日，使用由高到低濃度的檸檬酸鈉緩沖液進行梯度洗脫，除去多余的探針，然后向切片中滴加50μl 封閉液，在37 ℃環(huán)境下封閉30 分鐘，然后逐滴添加50μl 生物素化的小鼠抗人地高辛抗體，并在37 ℃環(huán)境下孵育120 分鐘，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3次，每次5 分鐘，滴加50 μl 鏈球菌親和素-生物素復合物，在37 ℃環(huán)境下孵育30 分鐘，PBS 沖洗3次，逐滴添加生物素化過氧化物酶50 μl，在37 ℃環(huán)境下孵育30 分鐘，PBS 沖洗3 次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5 分鐘，蘇木素復染，干燥透明后，用中性樹脂封片。

1.3 評價標準

以探針雜交溶液替換為無探針雜交前溶液作為陰性對照，隨機選取5 個高倍視野（×400），采用免疫組織化學染色，根據(jù)染色強度計分：細胞無染色，計0 分；細胞呈淺棕色，計1 分；細胞呈棕色、無背景色或細胞呈深褐色、背景為淺棕色，計2 分；細胞呈深褐色，無背景色，計3 分。按陽性細胞占比計分：無陽性細胞，計0 分；陽性細胞占比≤25%，計1 分；25%﹤陽性細胞占比﹤50%，計2 分；陽性細胞占比≥50%，計3 分。二者之積為最終得分，即0～1 分為陰性，2～3 分為弱陽性，4～7 分為陽性，≥8 分為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 LINC00261 在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況

LINC00261 在結直腸癌組織中陽性表達率為62.79%（54/86），明顯高于癌旁組織的8.14%（7/86），差異有統(tǒng)計學意義（

χ

=53.751，

P

﹤0.01）。（圖1）

圖1 原位雜交技術檢測LINC00261在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況（HE染色，×400）

2.2 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中LINC00261 表達情況的比較

不同分化程度、TNM 分期、是否發(fā)生淋巴結轉移的結直腸癌患者結直腸癌組織中LINC00261 陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.05）；不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑的結直腸癌患者結直腸癌組織中LINC00261 陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中LINC00261 表達情況的比較（n=86）

3 討論

結直腸癌的發(fā)病率和病死率都很高，而且近年來呈年輕化趨勢增長。早期結直腸癌手術加放化療治愈率高，但復發(fā)和轉移的結直腸癌仍然很難治愈，因此，迫切需要新的早期診斷、預測預后的標志物。

lncRNA 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關系密切，越來越多的證據(jù)表明，失調(diào)的lncRNA 與腫瘤的發(fā)病、復發(fā)和預后不良有關，可作為腫瘤早期診斷的新型生物標志物。LINC00261 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關的lncRNA。在乳腺癌細胞中，沉默LINC00261 可顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲，誘導G/G期阻滯，促進細胞凋亡，抑制細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）表達，增強上皮鈣黏素（E-cadherin）表達。在人胰腺癌和人肺癌細胞系中，抑制LINC00261 表達可抑制細胞的侵襲和遷移能力。上述研究表明，LINC00261 影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，目前尚不清楚LINC00261 在結直腸癌中的作用。

本研究應用原位雜交技術檢測lncRNA LINC00261 的表達，原位雜交是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交，再應用標記物相關的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術，其具有較高的靈敏度和特異度，可作為半定量檢測方法。本研究結果顯示，LINC00261在結直腸癌組織中陽性表達率為62.79%（54/86），明顯高于癌旁組織的8.14%（7/86），差異有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.01）。表明LINC00261在結直腸癌組織中的表達水平明顯升高，與結直腸癌的發(fā)生有關，這可能是由于高表達的LINC00261 抑制相關蛋白的合成，進而導致細胞生物學功能的改變，最終使細胞發(fā)生癌變。本研究進一步分析了不同臨床特征結直腸癌患者癌組織中LINC00261 表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，不同分化程度、不同TNM 分期、是否發(fā)生淋巴結轉移的結直腸癌患者癌組織中LINC00261 的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（

P

﹤0.05），即分化程度越低、TNM 分期越高、有淋巴結轉移，則結直腸癌患者癌組織中LINC00261 陽性表達率越高，其中分化程度、TNM 分期是腫瘤惡性生物學行為的表現(xiàn)，且淋巴結轉移是結直腸癌患者預后不良的重要指標，提示LINC00261 的異常表達可能預示著結直腸癌患者預后不良。由此，LINC00261 有可能作為預測結直腸癌患者不良預后的潛在生物標志物。

綜上所述，LINC00261 在結直腸癌組織中的表達明顯升高，與結直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，其有可能成為結直腸癌潛在的診斷標志物。本研究在今后也將擴大樣本收集量，以進一步確認LINC00261 表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系，并對相關機制進行深入研究。