基于Oncomine 芯片數(shù)據(jù)庫分析低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4在甲狀腺乳頭癌中的表達(dá)及意義△

馮鑫源，田昀靈，傅松波，邴志桐，趙楠，洪成恩，王素媛，龔文倩，吳嘯天

1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州730000

2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，蘭州730000

3中國科學(xué)院近代物理研究所，蘭州7300000

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）約占所有惡性腫瘤的1%，且在內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤中居首位。世界衛(wèi)生組織對TC 進(jìn)行分型，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）在人群中最常見，占75%～80%，且惡性度相對較低，臨床預(yù)后較好；其次是濾泡性癌、髓樣癌和未分化癌。近年來，中國TC 的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，在美國TC 已成為威脅人們生命健康的首位疾病。Hucz等研究證實(shí)，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4（lowdensity lipoprotein receptor related protein 4，LRP4）在PTC組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)癌旁組織，提示LRP4 可能是甲狀腺癌的致癌因子。Zhou 等通過對19 例PTC 患者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)LRP4在腫瘤組織及PTC細(xì)胞系中高表達(dá)，不同PTC細(xì)胞系中的沉默

LRP4

基因，可以抑制腫瘤細(xì)胞在組織內(nèi)的侵襲和增殖，從體外實(shí)驗(yàn)的角度證明了LRP4作為致癌因子的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LRP4 主要是通過激活細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)PTC的轉(zhuǎn)移。Oncomine 數(shù)據(jù)庫是一個(gè)基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)選題需求設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究通過篩選Oncomine 數(shù)據(jù)庫中LRP4 的基因芯片信息，對相關(guān)資料進(jìn)行深入挖掘分析，得出其在PTC中的表達(dá)結(jié)果及其與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)檢索

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，第一步設(shè)定篩選條件“Gene：LRP4”可得到LRP4 在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況。第二步在上述檢索基礎(chǔ)上對分析類型、腫瘤類型、數(shù)據(jù)類型及參數(shù)進(jìn)行限制，添加檢索條件①“Analysis Type：Cancer

vs

Normal Analysis”；②“Cancer Type：Papillary Thyroid Gland Carcinoma”；③“Data Type：mRNA or DNA copy number”；④分析參數(shù)為“P-value ﹤1E-4，F(xiàn)old change=2，Gene rank=top10%”，可得到LRP4 在PTC中的表達(dá)情況。第三步繼續(xù)對臨床結(jié)局進(jìn)行限制，增加篩選條件“Clinical Outcome：Survival Status”，可得到LRP4 與PTC 患者預(yù)后的相關(guān)數(shù)據(jù)，可對生存狀態(tài)、隨訪時(shí)間、DNA 拷貝數(shù)值等數(shù)據(jù)進(jìn)行提取并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制生存曲線。

1.2 觀察指標(biāo)

研究

LRP4

基因在多種腫瘤組織中的表達(dá)情況，可通過檢索Oncomine 數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)情況并生成圖譜，其中紅色代表在腫瘤組織中高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)，顏色深淺表示表達(dá)程度。研究

LRP4

基因在PTC 中的表達(dá)情況，可通過數(shù)據(jù)庫中自帶的Meta 分析功能對多個(gè)獨(dú)立、同類型研究進(jìn)行綜合分析，其中紅、藍(lán)色表示的意義同上。此外，對于單個(gè)研究可通過

t

檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)分析，同時(shí)根據(jù)

LRP4

在正常組織及PTC 中mRNA 表達(dá)量的中位中心強(qiáng)度生成箱式圖，可通過圖像及表達(dá)強(qiáng)度判斷基因在不同研究中的表達(dá)情況。預(yù)后分析結(jié)果可通過生成的生存曲線進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將各項(xiàng)數(shù)據(jù)記錄于Excel 表格中，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線（根據(jù)生存狀態(tài)進(jìn)行篩選，分析數(shù)據(jù)均為DNA 數(shù)據(jù)），以

P

﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LRP4 在多種腫瘤中的表達(dá)情況

Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集了400項(xiàng)不同腫瘤的研究結(jié)果，包括頭頸部腫瘤、肺癌、肝癌、胃癌、腎癌等，其中LRP4表達(dá)明顯增高的有11項(xiàng)，表達(dá)明顯降低的有7 項(xiàng)（一篇文獻(xiàn)可包含多個(gè)數(shù)據(jù)集，故參考文獻(xiàn)總數(shù)小于數(shù)據(jù)集總數(shù)）。LRP4在頭頸部腫瘤中高表達(dá)的研究有5 項(xiàng)，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的研究有2項(xiàng)，在腦及中樞系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)的研究有1 項(xiàng)，其他腫瘤中在生殖細(xì)胞腫瘤中高表達(dá)的研究有2項(xiàng)；LRP4在乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、部分結(jié)直腸癌中低表達(dá)。（圖1）

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中LRP4在多種腫瘤中的表達(dá)情況

2.2 LRP4 在PTC 中的表達(dá)情況

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，自2006年起共有3篇文獻(xiàn)涉及LRP4 在PTC 組織和正常組織中的表達(dá)情況，共5 個(gè)mRNA 數(shù)據(jù)集包含了135 例樣本。文章分別發(fā)表于

Clin Cancer Res

、

Proc Natl Acad Sci U S A

雜志。對這5 項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)行Meta 分析顯示，LRP4 在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為11，

P

=3.06×10，提示LRP4在PTC中高表達(dá)。

2.3 LRP4 在正常組織及不同PTC 組織中的差異表達(dá)情況

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中，LRP4 在上述5 項(xiàng)數(shù)據(jù)集中正常組織及PTC 組織中的差異表達(dá)結(jié)果顯示，LRP4 在PTC 及其不同分型（包括濾泡型PTC及柱狀細(xì)胞變異性PTC）組織中的表達(dá)量均明顯高于正常組織（

P

﹤0.01）。（表2）

表2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫5 項(xiàng)數(shù)據(jù)集中LRP4 在正常組織及PTC 組織中的差異表達(dá)情況

2.4 LRP4 與PTC 患者預(yù)后的關(guān)系

在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中，對“Clinical Outcome：Survival Status”進(jìn)行限制，篩選出一癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）DNA 數(shù)據(jù)集，其中包括1012 例樣本信息，

LRP4

基因表達(dá)與正常組織有差異的樣本共505 例，其中PTC 組織327 例（高表達(dá)164 例，低表達(dá)163 例），對數(shù)據(jù)進(jìn)行提取并進(jìn)行分析顯示，LRP4 高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=0.423，

P

=0.515）。（圖2）

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中LRP4高表達(dá)（n=164）與低表達(dá)（n=163）PTC患者的生存曲線

3 討論

頭頸部腫瘤的相關(guān)發(fā)病資料顯示，TC 的發(fā)病率居首位，是臨床上最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其中又以PTC 最為多見。近幾十年TC 在世界各國的發(fā)病率呈快速增長趨勢，尤其在近十年來發(fā)病人數(shù)迅速增加。全球流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2018 年TC 患者約56.7 萬例，占全部腫瘤患病人數(shù)的3.1%，在世界居第九位，在中國居第七位。甲狀腺癌的致病因素復(fù)雜，但主要與放射性物質(zhì)、碘攝入量、肥胖、性激素、遺傳因素、心理因素、社會(huì)因素和生活壓力等有關(guān)，且不同性別、年齡和地區(qū)患者之間存在明顯差異，但其具體病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。探索TC 尤其是PTC 的發(fā)病原因、機(jī)制及精準(zhǔn)治療方法是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

LRP4是低密度脂蛋白受體家族的成員之一，由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、O 寡糖修飾域、4 個(gè)β螺旋槳結(jié)構(gòu)域及8 個(gè)LDLa 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

LRP4

起初為神經(jīng)肌肉疾病的關(guān)鍵基因，近些年研究發(fā)現(xiàn)其水平與血漿中膽固醇含量有關(guān)。而腫瘤發(fā)展和遷延又與膽固醇水平相關(guān)，有研究證明低密度脂蛋白可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展惡化。在膽固醇介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞生長過程中，LRP4 可通過結(jié)合apoE 抑制神經(jīng)細(xì)胞的生長。Wei 等研究證實(shí)，PTC 患者LRP4 表達(dá)水平升高，提示LRP4 可能在PTC 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，LRP4 促進(jìn)PTC 的增殖、遷移和侵襲。研究表明，敲減

LRP4

可抑制TPC-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而過表達(dá)LRP4 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miRNA-140 對TPC-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。因此，LRP4 為PTC 的診斷、治療以及預(yù)后提供新的思路和靶點(diǎn)。Oncomine 數(shù)據(jù)庫是目前世界上最大的基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，注冊賬戶后可以通過使用過濾器挖掘腫瘤相關(guān)的基因信息。本研究所有資料都來自該數(shù)據(jù)庫中的基因芯片數(shù)據(jù)，研究方法一致。通過對Oncomine 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行深入挖掘結(jié)果顯示，LRP4 在頭頸部腫瘤、結(jié)直腸癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中高表達(dá)，且LRP4 在TC中高表達(dá)。目前有研究顯示，LRP4 可通過誘導(dǎo)磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)PTC 的增殖、遷移和侵襲；

LRP4

基因敲除可改善PTC 細(xì)胞的攻擊行為，表明LRP4 可能是PTC 的一個(gè)有效的生物標(biāo)志物，也是一個(gè)有用的治療靶點(diǎn)。此外，本研究也存在一定局限性，由于Oncomine 數(shù)據(jù)庫中收錄數(shù)據(jù)的限制，對于LRP4 與TC 患者生存狀態(tài)的研究僅利用一項(xiàng)DNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行間接分析，未直接通過mRNA 數(shù)據(jù)探索LRP4 表達(dá)差異與患者預(yù)后之間的關(guān)系。盡管通過對數(shù)據(jù)庫PTC 基因芯片信息進(jìn)行了深入分析，但由于Oncomine 數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)量的限制，研究結(jié)果還需進(jìn)一步結(jié)合臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。LRP4 在PTC 中的作用機(jī)制及臨床意義還有待更多研究進(jìn)一步探索和完善。綜上所述，通過對Oncomine 基因芯片數(shù)據(jù)庫中腫瘤相關(guān)基因的信息進(jìn)行深入挖掘，發(fā)現(xiàn)基因

LRP4

在PTC 組織中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)，有助于豐富LRP4 在PTC 精準(zhǔn)治療中的理論依據(jù)，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。