粉紅螺旋聚孢霉67-1短鏈脫氫酶基因CrSdr功能研究

陳瑩瑩，王亞楠，呂斌娜，譚曉東，李世東，孫漫紅*，馬桂珍

（1.江蘇海洋大學江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，連云港 222000；2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193；3.北京市土肥工作站，北京 100029）

粉紅螺旋聚孢霉Clonostachys rosea是一類分布廣泛的絲狀真菌，可以寄生多種植物病原真菌，如核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯絲核菌Rhizoctonia solani和灰葡萄孢Botrytis cinerea，還可以分泌抗菌和植物生長素類活性物質，顯示出良好的生防潛力[1-4]。近年來，對粉紅螺旋聚孢霉功能基因的挖掘也不斷深入，其中對細胞壁降解酶和物質運輸與代謝相關蛋白編碼基因的研究最為廣泛。生防真菌在寄生過程中，其分泌的幾丁質酶、纖維素酶和葡聚糖酶等細胞壁降解酶可直接破壞、消解病原真菌細胞壁，為其后續(xù)的侵入、定殖和擴展創(chuàng)造條件，并最終抑制病原菌的擴展與對植物的侵染[5,6]。Tzelepis等[7]發(fā)現敲除幾丁質酶基因chiC2后，粉紅螺旋聚孢霉對灰葡萄孢和立枯絲核菌的抑制能力顯著減弱，而過表達幾丁質酶基因Chi67?1能夠顯著提高其對核盤菌菌核的寄生能力和對大豆菌核病的防治效果[8]。Mamarabadi等[9]發(fā)現粉紅螺旋聚孢霉與黃色鐮刀菌Fusarium culmorum互作時會誘導N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因cr-nag1上調表達。粉紅螺旋聚孢霉生長和代謝過程中一些物質運輸與代謝相關蛋白也會影響其寄生和拮抗能力。研究表明，熱激蛋白70編碼基因crhsp能夠影響粉紅螺旋聚孢霉菌落形態(tài)，基因缺失后對核盤菌的寄生能力顯著降低，敲除ABCG29轉運蛋白基因可導致該類生防菌對灰葡萄孢和禾谷鐮刀菌的抑制作用下降[10,11]。Dubey等[12]在粉紅螺旋聚孢霉中發(fā)現了2個含有細胞溶解酶結構域的蛋白LysM1和LysM2，能夠影響自身孢子的萌發(fā)和菌絲生長，同時降低其對植物真菌病害的生防作用。

短鏈脫氫酶（short-chain dehydrogenase，SDR）廣泛存在于各類生物體中，是一類重要的NAD(P)(H)依賴型氧化還原酶，也是迄今為止發(fā)現的最古老和最大的蛋白質超家族之一[13]。短鏈脫氫酶催化功能多樣，可通過參與物質代謝及氧化還原反應[14,15]，調節(jié)生物體內多種生理生化反應[16,17]。有研究表明，SDR通過參與植物的初級和次生代謝影響植物的生長、發(fā)育和對逆境的反應[18]。SDR還可以誘導植物產生系統(tǒng)抗性，阻礙細菌性病菌對馬鈴薯的侵染[19]。在絲狀真菌中，短鏈脫氫酶基因參與了病原真菌的致病過程。研究發(fā)現，稻瘟病菌Magnaporthe oryzae短鏈脫氫酶基因MoSDR1能夠影響分生孢子的形成、孢子萌發(fā)和附著胞的發(fā)育，降低稻瘟病菌的致病力[20]。在生防真菌中，氧化還原酶類基因通過調控寄生關鍵酶的合成以及一些次級代謝產物，如毒素和抗生素的合成與代謝，從而影響對寄主細胞的抑制作用與寄生能力。Malmierca等[21]發(fā)現，細胞色素P450基因缺失后葦狀木霉Trichoderma arundinaceum對灰葡萄孢和立枯絲核菌的抑制作用明顯減弱。在哈茨木霉T.harzianum中過表達NADPH氧化酶基因nox1能夠誘導蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶等幾種細胞壁降解酶基因表達水平上調，并顯著提高對終極腐霉Pythium ultimum的拮抗作用[22]。但迄今，短鏈脫氫酶基因在生防真菌中的生物學功能尚不明確。

粉紅螺旋聚孢霉67-1是實驗室分離到的一株高效生防菌株，前期從寄生核盤菌轉錄組中獲得1個差異表達的短鏈脫氫酶基因CrSdr[23]。本研究通過基因敲除與回補及生物學測定，探討其在粉紅螺旋聚孢霉生防中的作用，該研究將為深入揭示粉紅螺旋聚孢霉生防作用機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、質粒及植物材料

粉紅螺旋聚孢霉Clonostachys rosea 67-1分自海南省菜園土壤。大豆菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum分自黑龍江省大豆田病株，番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea、黃瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum和甘藍枯萎病菌F.oxysporum f.sp.conglutinans分自河北廊坊溫室病株。以上菌株由中國農業(yè)科學院植物保護研究所土傳病害組保存。質粒pKH-KO和pKN由中國農業(yè)科學院植保所細菌病害研究組惠贈。供試大豆：中黃13號，購買于北京中蔬種業(yè)公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 L。PD培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，水1 L，調節(jié)pH 7.0。胡蘿卜培養(yǎng)基：新鮮胡蘿卜洗凈去皮，切成1 cm3左右小塊，置于三角瓶中，裝量為1/3。TB3培養(yǎng)基：酵母浸粉3 g，酸水解酪素3 g，蔗糖200 g，水1 L。以上培養(yǎng)基121 ℃濕熱滅菌25 min。

1.3 CrSdr基因生物信息學分析

根據菌株67-1全基因組數據[23]獲得CrSdr基因DNA序列。使用NCBI BlastP（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）分析氨基酸序列，使用ExPASy計算預測蛋白的分子量、等電點和親疏水性，分別使用SignalP 4.1和TMHMM預測信號肽位點和跨膜區(qū)域，應用CDD預測CrSdr基因功能域，采用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

1.4 菌核誘導下CrSdr基因表達量監(jiān)測

1.4.1 菌核的培養(yǎng) 將核盤菌接種于PDA上，26 ℃培養(yǎng)7～10 d，使用打孔器將菌落打成直徑為3 mm的菌餅，接種至胡蘿卜培養(yǎng)基中，每瓶10～15塊。室溫光照培養(yǎng)20 d，待培養(yǎng)基中產生大量的黑色顆粒狀菌核后，用大量水反復沖洗培養(yǎng)物，去除胡蘿卜殘渣。將菌核自然晾干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RNA樣品制備 將67-1接種于PDA平板上培養(yǎng)7～10 d，加入無菌水洗脫孢子，調整菌懸液濃度至1×107孢子/mL。吸取100 μL均勻涂布于鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)48 h。選取大小一致的菌核，75%酒精浸泡30 s，再加入2.5% NaClO溶液消毒3 min，無菌水沖洗3次，置于滅菌濾紙上吸去多余水分，超凈工作臺中吹干。將菌核鋪滿67-1平板，26 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于8、24和48 h時移去菌核，收集67-1菌絲，-80 ℃低溫冰箱保存。以沒有放置菌核的67-1純培養(yǎng)為對照。每個處理5個重復。

1.4.3 RNA提取及反轉錄 采用RNeasy Plant Mini Kit試劑盒（QIAGEN，德國凱杰生物公司）提取樣品RNA，DNase I（TransGen Biotech,北京全式金生物技術有限公司）去除基因組 DNA，反轉錄試劑盒（TIANGEN,天根生化科技有限公司）進行第一鏈cDNA的合成。

1.4.4 CrSdr基因表達量的定量監(jiān)測 以延伸因子EF1作為內參基因[25]，使用NCBI Primer-BLAST設計CrSdr基因及內參基因的熒光定量PCR引物CrSdr-qF/qR和EF1-F/R（表1）。采用Bio-Rad IQ 5實時熒光定量PCR檢測儀和SYBR Green Ⅰ對CrSdr基因表達水平進行定量分析。反應體系25 μL，其中2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各 1 μL，RNase-free ddH2O 10 μL。反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，40個循環(huán)；程序運行后，從55 ℃到95 ℃之間每隔0.5 ℃采集一次熒光，共81個循環(huán)。采用2-??Ct法計算CrSdr基因的相對表達水平[26]。每個處理3個重復。

1.5 CrSdr基因敲除與回補

1.5.1 敲除與回補載體的構建 利用同源重組原理，將CrSdr基因的上下游同源臂連接到帶有潮霉素B抗性標記的pKH-KO載體上，構建敲除載體pKH-KO-CrSdr。設計相應CrSdr基因的回補引物CrSdr-Com-F/R（表1），PCR擴增獲得CrSdr基因的全長序列（包括啟動子、蛋白質編碼區(qū)和終止子），將其克隆到pKN載體獲得回補載體pKN-CrSdr-Com。

1.5.2 原生質體轉化 采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法[27]將得到的基因敲除載體pKH-KO-CrSdr和回補載體pKN-CrSdr-Com分別轉入67-1和基因敲除突變株ΔCrSdr的原生質體，得到基因敲除和回補轉化子。分別以潮霉素B和G418為篩選標記，從PDA平板上篩選敲除轉化子和回補轉化子。將長出的菌落轉接到不含抗生素的PDA平板上，連續(xù)培養(yǎng)3代，獲得穩(wěn)定遺傳的敲除轉化子和回補轉化子。

1.5.3 基因敲除與回補菌株的篩選、鑒定 收集敲除和回補轉化子菌絲，提取DNA。設計引物（表1），進行PCR和DNA測序驗證。本研究所用引物合成及序列測定均由北京擎科生物科技有限公司完成。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 轉化子生物學特性測定

1.6.1 生長速率、產孢量和孢子萌發(fā)率 分別打取野生型菌株、敲除突變株和回補菌株的菌餅（直徑3 mm）接種于PDA平板中央，26 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落大小和形態(tài)，從第3 d開始測量菌落直徑，連續(xù)測定7 d，計算菌絲生長速率。培養(yǎng)10 d后，加入5 mL無菌水洗脫孢子，顯微鏡（BX41）下測定產孢量。調節(jié)各菌株孢子懸液濃度為1×107孢子/mL，接種于PD培養(yǎng)基中，26 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于8和16 h檢測孢子萌發(fā)情況。

1.6.2 對不同脅迫壓力的敏感性 PDA培養(yǎng)基中分別加入1 mol/L NaCl、1 mol/L KCl、1 mol/L山梨醇、20 mmol/L H2O2、0.2 mol/L CaCl2、0.03%十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.3 mg/mL剛果紅（CR）。其中H2O2于培養(yǎng)基滅菌后添加，其余均在滅菌前添加。將野生型菌株和突變菌株的菌餅（直徑3 mm）接種于不同脅迫壓力的平板中，26 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，并觀察菌落形態(tài)的變化。每個處理5個重復。

1.6.3 對幾種病原真菌的抑制作用 平板對峙法測定粉紅螺旋聚孢霉菌株對大豆菌核病菌、番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌和甘藍枯萎病菌的拮抗能力。打取不同菌株的菌餅（直徑3 mm）放置在距離PDA平板邊緣2 cm處，26 ℃下培養(yǎng)5 d，在平板另一端相同的位置接種直徑為3 mm的病原真菌菌餅，26 ℃培養(yǎng)20 d后測量生防菌株菌絲的擴展距離，計算抑菌活性。每個處理5個重復。

1.6.4 對菌核的寄生能力 選取大小一致的菌核，75%酒精和2.5% NaClO消毒后分別浸于粉紅螺旋聚孢霉孢子懸液中，10 min后取出吸干多余菌液，置于直徑9 cm的無菌濾紙上，26 ℃培養(yǎng)，分別于8、24和48 h在體視顯微鏡（SZX12，OLYMPUS）下觀察菌核寄生情況，并計算寄生率。7 d后，切片觀察菌核內部侵染情況。寄生等級：0＝菌核表面無寄生菌菌絲；1＝菌核表面有稀疏菌絲；2＝菌核被寄生菌菌絲覆蓋，但表皮未脫落；3＝菌核被寄生菌菌絲覆蓋，菌核表皮脫落；4＝菌核被菌絲覆蓋，菌核內部軟腐。每個菌株測定30個菌核，每個處理3個重復。

1.6.5 對大豆菌核病的防治效果 溫室盆栽測定粉紅螺旋聚孢霉野生型菌株和突變菌株對大豆菌核病的防治作用。選取籽粒飽滿的大豆種子，1% NaClO表面消毒3 min，無菌水沖洗3次，晾干，播種于直徑11 cm的塑料花盆中，每盆3粒種子。待大豆長到9片復葉時，在每片葉子的正面和背面均勻噴施濃度為1×107孢子/mL的粉紅螺旋聚孢霉孢子懸液，2 h后接種培養(yǎng)5 d的核盤菌發(fā)酵液，以只接種病原菌的處理為對照。溫室溫度25 ℃～28 ℃，相對濕度為60%，花盆隨機擺放。7 d后調查大豆葉片發(fā)病情況。分級標準：0＝無病斑；1＝病斑面積小于10%；2＝病斑面積10%～30%；3＝病斑面積30%～50%；4＝病斑面積50%以上。每3盆（共9株）為1個處理，每個處理3個重復。病情指數＝∑（各級病苗數×各級代表值）/調查總數×最高級代表值×100，防病效果（%）＝（CK病情指數－處理病情指數）/（CK病情指數）×100。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據采用Excel 2011和SPSS 24軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 CrSdr基因的生物信息學分析

生物信息學分析表明，基因CrSdr（GenBank No.MW661068）全長768 bp，無內含子，編碼255個氨基酸，預測的蛋白分子量為27.04 kDa，等電點6.51，為疏水性蛋白，無信號肽和跨膜結構域，該蛋白具有SDR結構域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CrSdr基因與鐮刀菌F.albosuccineum短鏈脫氫酶基因（KAF4471804.1）親緣關系最近（圖1）。

圖1 粉紅螺旋聚孢霉CrSdr基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of CrSdr of C.rosea

2.2 CrSdr基因的表達量分析

熒光定量對粉紅螺旋聚孢霉67-1 CrSdr基因的表達水平監(jiān)測表明，菌核誘導下CrSdr基因表達趨勢為先上調再下調，24 h時，CrSdr表達水平比對照提高4倍（圖2），與67-1寄生核盤菌轉錄組數據一致[23]。

圖2 菌核誘導下粉紅螺旋聚孢霉67-1菌株CrSdr基因的表達水平Fig.2 Expression levels of CrSdr in C.rosea 67-1 under the induction of S.sclerotiorum sclerotia

2.3 CrSdr基因敲除和回補驗證

篩選獲得248個潮霉素抗性轉化子，PCR驗證得到3個敲除突變株?CrSdr-1、?CrSdr-2和?CrSdr-3。PCR驗證結果顯示，敲除突變株中插入潮霉素抗性基因（1479 bp）。經CrSdr-YZ-F/R可擴增出3500 bp左右的片段，與預期片段一致。對擴增片段測序表明，CrSdr基因已被hph成功替換且未發(fā)生異位插入。將回補載體轉入ΔCrSdr-1，PCR驗證回補菌株ΔCrSdr-Com中存在目的基因片段（3016 bp）。測序結果表明，CrSdr基因成功插入突變株中（圖3）。

圖3 粉紅螺旋聚孢霉67-1突變株ΔCrSdr和ΔCrSdr-Com的PCR驗證Fig.3 PCR verification of ΔCrSdr and ΔCrSdr-Com mutants of C.rosea 67-1

2.4 CrSdr基因對粉紅螺旋聚孢霉生長和產孢的影響

粉紅螺旋聚孢霉CrSdr基因敲除后，菌株菌落大小、形態(tài)、菌絲生長速率和孢子萌發(fā)率均無明顯變化（圖4），但敲除突變株?CrSdr的產孢量比野生菌株增加了43.2%（表2）。

圖4 敲除CrSdr基因對粉紅螺旋聚孢霉67-1菌落形態(tài)的影響Fig.4 Effect of CrSdr deletion on the colony morphology of C.rosea 67-1

2.5 CrSdr基因對粉紅螺旋聚孢霉脅迫反應的影響

與67-1野生菌株和回補菌株?CrSdr-Com相比，敲除突變株?CrSdr在含有NaCl、KCl和山梨醇的PDA培養(yǎng)基中生長緩慢，對滲透壓脅迫表現出更強的敏感性，并且菌落形態(tài)發(fā)生了改變，菌絲較為疏松平坦。而CrSdr基因缺失后粉紅螺旋聚孢霉對CaCl2的敏感性有所降低（圖5）。

圖5 不同脅迫壓力下粉紅螺旋聚孢霉轉化子的菌落直徑Fig.5 Colony diameters of C.rosea mutants under different stresses

2.6 CrSdr基因對粉紅螺旋聚孢霉抗病原真菌活性的影響

敲除CrSdr基因后，粉紅螺旋聚孢霉對番茄灰霉病菌和大豆菌核病菌的擴展距離較野生型分別減少了23.1%和13.6%，抗菌活性顯著降低，基因回補后菌株的抗菌活性與野生型67-1一致（圖6，表3）。

表3 粉紅螺旋聚孢霉轉化子向4種病原真菌的擴展距離Table 3 Extended distances of C.rosea mutants towards 4 pathogenic fungi

2.7 CrSdr基因對粉紅螺旋聚孢霉寄生核盤菌菌核能力的影響

接種后8 h粉紅螺旋聚孢霉67-1菌絲開始在菌核表面生長，24 h時寄生率達到86.7%。敲除CrSdr基因后寄生率下降了44.9%，而回補菌株對菌核的寄生能力恢復。培養(yǎng)7 d后可以看到，野生型和回補菌株處理組菌核內部完全腐爛和軟化，而敲除突變株侵染菌絲稀疏，菌核仍較為堅硬。67-1和?CrSdr-Com對菌核的寄生能力達到4級，而?CrSdr的寄生能力僅為2級（圖7）。

2.8 敲除CrSdr基因對粉紅螺旋聚孢霉防治大豆菌核病作用的影響

接種核盤菌7 d后，對照組大豆葉片出現大面積黃褐色病斑，莖部發(fā)生褐變，植株病情多達到4級，粉紅螺旋聚孢霉67-1孢子液處理組病斑面積顯著減少，對大豆菌核病的防效達到68.9%。而敲除CrSdr基因后對病害的防效僅為34.1%，比野生型下降了50%以上?；蚧匮a后菌株的生防作用恢復到原來的水平（圖8，表5）。

圖8 粉紅螺旋聚孢霉CrSdr突變株對大豆菌核病的防治效果Fig.8 Control efficacy of CrSdr mutants of C.rosea against soybean Sclerotinia stem rot

3 討論

本研究從粉紅螺旋聚孢霉 67-1寄生核盤菌轉錄組中篩選到了一個顯著上調表達的編碼短鏈脫氫酶基因CrSdr，發(fā)現CrSdr基因缺失能夠提高生防菌分生孢子的數量、降低對菌核的寄生能力和生防效果。研究首次證明了CrSdr基因在粉紅螺旋聚孢霉重寄生過程和病害防控中發(fā)揮著重要作用。

氧化還原酶可以影響絲狀真菌的生長和產孢，進而影響其定殖和重寄生水平[21,28,29]。本研究中，我們發(fā)現CrSdr基因缺失不影響粉紅螺旋聚孢霉的正常生長，但是能顯著增加分生孢子的數量，證明CrSdr基因參與調控了粉紅螺旋聚孢霉的產孢過程。但前期也有對病原真菌的研究發(fā)現，敲除稻瘟菌 M.oryzae MoSDR1和禾谷鐮刀菌F.graminearum FgPex3基因會導致產分生孢子能力下降[20,28]，表明在不同的真菌中氧化還原酶基因調控產孢的方式不同。

真菌可以通過多種方式響應外源脅迫，維持細胞形態(tài)和正常的生理過程[30,31]。有研究發(fā)現，絲狀真菌受到外界高滲壓力后，可通過激活甘油合成相關酶基因的表達，在胞內積累高濃度甘油，提高細胞抵抗高滲脅迫反應的能力[32,33]。本試驗中，在高滲脅迫（NaCl、KCl和山梨醇）條件下短鏈脫氫酶基因敲除突變株表現出更強的敏感性，這與前人對禾谷鐮刀菌的研究結果一致[28,34]。我們還發(fā)現，基因缺失突變株在鹽脅迫下菌絲明顯減少，對叢枝菌根真菌Glomus intraradices的研究也表明，高滲脅迫使菌體生物量減少并使菌絲生長狀態(tài)發(fā)生改變[35]，但其作用機制仍需進一步探討。在后續(xù)的研究中，可以嘗試通過檢測生防菌細胞中甘油含量的變化，明確其在脅迫應答反應中的作用。

研究發(fā)現，粉紅螺旋聚孢霉67-1對供試4種病原真菌均有較好的抑制作用，能夠在病原菌菌落上擴展，而敲除突變株?CrSdr對番茄灰霉病菌、大豆菌核病菌和黃瓜枯萎病菌的定殖能力明顯減弱，但對甘藍枯萎病菌的抑制沒有發(fā)生明顯變化，這說明CrSdr基因參與不同病原菌的防控機制有可能存在差異。我們還發(fā)現，接種8 h后粉紅螺旋聚孢霉孢子開始萌發(fā)，菌絲開始在核盤菌菌核表面生長，隨著時間的推移對菌核表現出越來越強烈的寄生作用。在識別和侵染過程中，短鏈脫氫酶通過參與不同的信號傳遞途徑影響對宿主的寄生[36,37]。本研究結果表明，敲除CrSdr基因顯著降低了粉紅螺旋聚孢霉67-1對核盤菌菌核的寄生能力及對大豆菌核病的防治效果，推測短鏈脫氫酶基因的缺失可能影響了相關信號的傳遞，進而影響其生防能力。

通過本研究我們明確了短鏈脫氫酶基因CrSdr在粉紅螺旋聚孢霉寄生核盤菌和生防過程中發(fā)揮著重要作用。后期將在此基礎上，對粉紅螺旋聚孢霉不同侵染階段進行顯微形態(tài)和生物學研究，結合分子生物學分析明確CrSdr基因在菌寄生過程中的作用，為揭示粉紅螺旋聚孢霉生防機制奠定基礎。