斑鞘豆葉甲成蟲對非寄主植物揮發(fā)物的觸角電位和行為反應(yīng)

樊瑞冬，張益愷,2，畢嘉瑞，徐 偉*，臧連生*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/生物防治研究所，長春 130118；2.吉林人參研究院，通化 134001）

斑鞘豆葉甲Colposcelis signata (Motschulsky)，屬鞘翅目Coleoptera，葉甲科Chrysomelidae，是大豆苗期的重要害蟲之一。成蟲為害大豆葉片、地下莖部、子葉及嫩芽，嚴重時為害每株大豆苗的成蟲超過 20頭，葉肉幾乎被吃光，致使豆株早衰，幼苗干枯死亡，嚴重影響大豆產(chǎn)量[1]。目前對該蟲主要采取化學(xué)防治[2]，但是化學(xué)農(nóng)藥不僅會污染土壤、水體和大氣，在環(huán)境中殘留，而且隨著化學(xué)殺蟲劑的長期大量使用，斑鞘豆葉甲的抗藥性會逐漸增強，防控難度不斷加大。

植物能夠自身產(chǎn)生并釋放醇、醛、酮、酯和萜烯類等揮發(fā)性化合物[3]，不同植物釋放的揮發(fā)物組成與含量不同，這成為植食性昆蟲寄主定位的信號和線索。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲能夠通過嗅覺感受器識別寄主植物揮發(fā)物，以不同受體神經(jīng)元將氣味編碼傳遞給腦，進而調(diào)控昆蟲的多種行為，諸如寄主選擇、交配產(chǎn)卵、取食和傳粉等[4]。植食性昆蟲對寄主植物揮發(fā)物一般表現(xiàn)為趨向反應(yīng)，對非寄主植物的揮發(fā)物表現(xiàn)為不選擇性和驅(qū)避性。如蕓苔屬植物特異性釋放的較高含量異硫氰酸酯吸引甘藍蚜蟲 Brevicoryne brassicae 定殖和取食[5]。茶尺蠖Ectropis obliqua成蟲對寄主植物迷迭香、茶葉和吸毒草的氣味表現(xiàn)為引誘反應(yīng)，而對非寄主植物薰衣草的氣味表現(xiàn)為不反應(yīng)[6]。另外橘潛葉蛾P(guān)hyllocnistis citrella的寄主植物葉片混入非寄主印楝Azadirachta indica、馬纓丹Lantana camara和藿香薊Tropic ageratum的葉片后還能夠干擾其雌蛾產(chǎn)卵，導(dǎo)致著卵量明顯低于對照組，并產(chǎn)生驅(qū)避作用[7]。昆蟲通過植物揮發(fā)物信號來辯別寄主和非寄主植物，保證在寄主植物上取食和獲取營養(yǎng)，滿足生長發(fā)育和繁殖的需要，避免了在非寄主植物上中毒和營養(yǎng)不良。但也有少數(shù)非寄主植物對昆蟲具有顯著的引誘作用，如菜蛾 Plutella maculipennis對歐洲山芥Barbarea vulgaris和豆莢螟Etiella zinckenella對菽麻Crotalaria jumcea有產(chǎn)卵選擇偏好，這兩種植物均含有次生有毒物質(zhì)，對兩種幼蟲具有驅(qū)避和毒殺作用[8,9]。另外，華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita和銅綠麗金龜Anomala corpulenta雖然對蓖麻沒有產(chǎn)卵偏好，但蓖麻對兩種昆蟲的引誘作用顯著超過了其寄主植物大豆，同樣取食蓖麻后會導(dǎo)致中毒麻痹[10,11]?；诜羌闹髦参飺]發(fā)物對昆蟲嗅覺行為的干擾，影響寄主的選擇，近年來已經(jīng)逐漸將非寄主植物揮發(fā)物應(yīng)用于害蟲防控中，并取得了良好的效果[6,12-14]。

本文根據(jù)已有對大豆植株揮發(fā)物的分析檢測結(jié)果[15-17]，選取了醇、醛和萜烯類等斑鞘豆葉甲的非寄主16種揮發(fā)物，通過觸角電位（EAG）和Y型管嗅覺儀技術(shù)，檢測斑鞘豆葉甲對揮發(fā)物的EAG反應(yīng)和行為反應(yīng)，篩選對其具有生物活性作用的植物揮發(fā)物，為研發(fā)斑鞘豆葉甲植物行為調(diào)控劑，實現(xiàn)該害蟲的綠色生物防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

斑鞘豆葉甲成蟲于2018、2019年5月中旬采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗田，將成蟲區(qū)分雌、雄后接入具有通氣孔的50 mL離心管中，每個離心管接入5頭成蟲，以新鮮大豆葉在光溫培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)（25 ℃±1 ℃，RH 50%±5%，光周期16L:8D）。

1.2 供試非寄主植物揮發(fā)物

供試非寄主植物16種揮發(fā)物包括 6種萜烯類揮發(fā)物：(1R)-(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、(R)-(+)-檸檬烯、1,6-二甲基-2,4,6-辛三烯、1-十二烯、β-月桂烯；5種醇醛類揮發(fā)物：反-2-己烯-1-醇、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、2-苯乙醇、反-2-己烯醛；5種其他揮發(fā)物：異戊酸乙酯、乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯、1,8-桉葉素、十三烷的標準品。樣品購自美國Sigma公司，純度均在95%以上。用液體石蠟（化學(xué)純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）配制成10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol/L共5種濃度梯度的揮發(fā)物溶液備用。

1.3 觸角電位測定

觸角電位儀（荷蘭Syntech公司）由CS-55氣味刺激控制裝置、MP-15微動操縱器、IDAC2數(shù)據(jù)采集控制器和觸角電位記錄顯示輸出裝置組成。測試前在“Z”型濾紙條（20 mm×5 mm）上均勻滴加10 μL待測溶液，溶劑揮發(fā)后放入巴斯德管中，巴斯德管末端與觸角電位儀氣體刺激控制裝置相連。取饑餓24 h后的健康斑鞘豆葉甲雌、雄蟲，在體視解剖鏡下將觸角自基部切下，再切除其端部少許，用導(dǎo)電膠固定在金屬電極上，電極通過銀絲與信號放大器相連。測試時，調(diào)節(jié)觸角電位儀的工作狀態(tài)，測試氣體流量設(shè)定為0.4 L/min，待基線平穩(wěn)后，開始測試。每個樣品雌、雄蟲各測試10根觸角，重復(fù)3次。刺激時間為0.3 s，每2次刺激時間間隔不少于60 s。試驗以液體石蠟的EAG反應(yīng)值作為對照，以丙酮（分析純，北京化工廠）為參照，對照與處理交替進行。EAG相對反應(yīng)值＝（處理反應(yīng)值－對照反應(yīng)值）/（參照反應(yīng)值－對照反應(yīng)值）[18]。

1.4 行為反應(yīng)測定

試驗在暗室內(nèi)操作，反應(yīng)測試系統(tǒng)包括 GQC-1型大氣采樣儀（北京市勞動科學(xué)保護研究所）、活性炭瓶、LZB4型玻璃轉(zhuǎn)子流量計（常州雙環(huán)熱工儀表有限公司）、加濕瓶、味源瓶和Y型嗅覺儀構(gòu)成，由聚四氟乙烯管依次連接。Y型嗅覺儀主臂長15 cm，兩側(cè)臂等長為11 cm，二者夾角為90°，內(nèi)徑2 cm。在嗅覺儀前上方放置1盞40 W白熾燈，并保持左右兩側(cè)臂光照強度一致，氣體流速設(shè)定為300 mL/min。試驗在斑鞘豆葉甲活躍15：00～18：00進行，將“Z”型濾紙條滴加10 μL揮發(fā)物溶液后放入一側(cè)味源瓶中，在另一側(cè)味源瓶中放入滴有相同體積石蠟的濾紙條作為對照。將單頭饑餓24 h的健康斑鞘豆葉甲成蟲接入主臂管口，待其爬過主臂1/3處，開始計時。以5 min內(nèi)進入氣味源側(cè)臂且停留30 s以上視為選擇該側(cè)臂的味源，進入對照側(cè)臂且停留30 s以上視為選擇對照；若試蟲停留在主臂5 min以上，則記為對該揮發(fā)物不選擇。每種揮發(fā)物各測試45頭雌、雄成蟲。每測試2頭成蟲，更換1次濾紙條，Y型管左右調(diào)換1次方向。更換不同揮發(fā)物和不同濃度樣品時用丙酮和蒸餾水先后沖洗Y型管并置于100 ℃烘箱2 h，以排除干擾。植物揮發(fā)物對斑鞘豆葉甲的驅(qū)避率＝（選擇對照氣味源的總蟲數(shù)/測試總蟲數(shù)）×100%，引誘率＝（選擇樣品氣味源的總蟲數(shù)/測試總蟲數(shù)）×100%[18]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 25以單因素方差分析法分析斑鞘豆葉甲成蟲對同一濃度不同揮發(fā)物和同一揮發(fā)物不同濃度的EAG反應(yīng)相對值，及成蟲對同一濃度下具有引誘或驅(qū)避作用的不同揮發(fā)物的行為反應(yīng)差異性，以Duncan’s新復(fù)極差法進行顯著性檢驗。同一揮發(fā)物雌、雄蟲間的EAG反應(yīng)差異顯著性采用Student’s t檢驗。以卡方檢驗分析雌、雄成蟲對處理和對照行為選擇的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑鞘豆葉甲對10-1 mol/L不同揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

斑鞘豆葉甲成蟲對10-1mol/L不同揮發(fā)物的EAG反應(yīng)結(jié)果顯示，6種萜烯類揮發(fā)物可引起較強的EAG反應(yīng)，雄蟲反應(yīng)強于雌蟲，EAG反應(yīng)相對值由高到低依次為(1R)-(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯，β-月桂烯，(R)-(+)-檸檬烯，1-十二烯，1,6 -二甲基-2,4,6-辛三烯。成蟲對(1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-β-蒎烯的反應(yīng)顯著強于其他揮發(fā)物，雄蟲 EAG相對反應(yīng)值分別為 2.10和 2.04。雄蟲對(1R)-(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、(R)-(+)-檸檬烯和β-月桂烯的反應(yīng)明顯強于雌蟲。斑鞘豆葉甲對5種醇、醛類揮發(fā)物反應(yīng)較強，且不同揮發(fā)物間差異顯著。雌、雄蟲對反-2-己烯醛反應(yīng)最強，其EAG相對反應(yīng)值分別為1.96和1.82，其次是反-2-己烯-1-醇。雌蟲對反-2-己烯-1-醇、2-乙基-1-己醇和反-2-己烯醛的反應(yīng)明顯強于雄蟲，而雄蟲對2-苯乙醇和芳樟醇的EAG反應(yīng)則強于雌蟲。斑鞘豆葉甲對異戊酸乙酯等其他5種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對值較低，除水楊酸甲酯外均低于1.0，雄蟲反應(yīng)均強于雌蟲，水楊酸甲酯可引起雌、雄蟲間顯著的EAG反應(yīng)（表1）。

表1 斑鞘豆葉甲成蟲對濃度10?1 mol/L不同揮發(fā)物的EAG反應(yīng)Table 1 EAG responses of Colposcelis signata adults to 10-1 mol/L plant volatiles

2.2 斑鞘豆葉甲對不同濃度揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

隨著揮發(fā)物濃度增加，斑鞘豆葉甲雌、雄蟲EAG反應(yīng)變化趨勢相同（圖1），反應(yīng)值逐漸增加，雄蟲對不同濃度的 4種萜烯類揮發(fā)物、2-苯乙醇和水楊酸甲酯的反應(yīng)強于雌蟲，對反-2-己烯-1-醇、2-乙基-1-己醇和反-2-己烯醛的反應(yīng)弱于雌蟲。濃度從10-5mol/L增加到10-2mol/L，成蟲對(1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-β-蒎烯 EAG反應(yīng)顯著增強，并且雄蟲反應(yīng)均明顯強于雌蟲，雄蟲對 10-2mol/L (1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-β-蒎烯EAG反應(yīng)相對值分別為2.23和2.09，是10-5mol/L濃度下的2.51和2.49倍，濃度效應(yīng)顯著。當濃度增加到10-1mol/L時，成蟲對兩種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對值稍降低（表1），這表明10-1mol/L (1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-β-蒎烯超過了斑鞘豆葉甲EAG濃度效應(yīng)閾值。成蟲對低濃度的(R)-(+)-檸檬烯、2-乙基-1-己醇和水楊酸甲酯反應(yīng)強度增加不顯著。

圖1 斑鞘豆葉甲成蟲對不同濃度揮發(fā)物的EAG反應(yīng)Fig.1 EAG responses of Colposcelis signata to different plant volatiles in five concentrations

2.3 斑鞘豆葉甲對10-1 mol/L不同揮發(fā)物的行為反應(yīng)

斑鞘豆葉甲對10-1mol/L濃度的6種萜烯類化合物表現(xiàn)為顯著的驅(qū)避反應(yīng)，雄蟲反應(yīng)強于雌蟲，其中(1R)-(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯和β-月桂烯的驅(qū)避反應(yīng)較強，對雄蟲驅(qū)避率分別為，86.7%、81.3%和81.1%，對雌蟲的驅(qū)避率均超過70%。除芳樟醇外斑鞘豆葉甲對其他醇、醛類揮發(fā)物均表現(xiàn)為誘引反應(yīng)，其中反-2-己烯-1-醇誘引作用最強，對雌、雄蟲的引誘率分別為68.9%和65.7%。反-2-己烯-1-醇、2-乙基-1-己醇和反-2-己烯醛對雌蟲的引誘作用強于雄蟲。芳樟醇對成蟲具有顯著的驅(qū)避作用，且雄蟲反應(yīng)強于雌蟲。斑鞘豆葉甲對異戊酸乙酯等其他揮發(fā)物具有顯著的誘引反應(yīng)，雄蟲反應(yīng)強于雌蟲，并且水楊酸甲酯對雌、雄蟲的誘引作用超過其他4種揮發(fā)物（表2）。

2.4 斑鞘豆葉甲對不同濃度揮發(fā)物的嗅覺反應(yīng)

斑鞘豆葉甲成蟲對不同濃度的4種萜烯類揮發(fā)物均表現(xiàn)為明顯的驅(qū)避反應(yīng)（圖2），在10-5mol/L濃度下驅(qū)避率超過48.9%。其中(1R)-(+)-α-蒎烯和(R)-(+)-檸檬烯的驅(qū)避作用隨濃度增加而增強，而(-)-β-蒎烯和β-月桂烯在10-2mol/L濃度下的驅(qū)避作用最強，對雄蟲的驅(qū)避率分別為87.8%和83.3%，在10-1mol/L濃度下驅(qū)避率反而降低（表2），這表明該濃度超過了斑鞘豆葉甲嗅覺反應(yīng)的濃度閾值。對于5種醇、醛和其他揮發(fā)物，隨濃度增加對斑鞘豆葉甲的引誘作用增強，表現(xiàn)出濃度效應(yīng)。但2-苯乙醇在10-5和10-4mol/L濃度下對斑鞘豆葉甲的引誘作用不顯著，不同濃度的反-2-己烯醛對斑鞘豆葉甲均無顯著的引誘作用。在10-4～10-1mol/L濃度范圍內(nèi)水楊酸甲酯對斑鞘豆葉甲成蟲均具有顯著的引誘作用。

表2 斑鞘豆葉甲成蟲對濃度10-1 mol/L不同揮發(fā)物的行為反應(yīng)Table 2 Behavioral responses of Colposcelis signata adults to 10-1 mol/L plant volatiles

3 討論

近年來對昆蟲與植物化學(xué)互作的研究日益深入，二者協(xié)同進化的結(jié)果是植食性昆蟲形成了特定的取食范圍[19]。植物揮發(fā)物通過昆蟲的嗅覺系統(tǒng)調(diào)節(jié)昆蟲的取食和行為，在昆蟲定殖和繁衍過程中發(fā)揮著重要的引導(dǎo)作用。昆蟲生存環(huán)境中大多數(shù)為非寄主植物，它們也會影響昆蟲的寄主選擇，干擾對信息素的定向反應(yīng)，在自然界中具有重要的生態(tài)功能[20,21]。

本研究選擇的16種非寄主植物揮發(fā)物在10-1mol/L濃度下均能引起斑鞘豆葉甲成蟲的EAG反應(yīng)，并且雌、雄蟲的濃度反應(yīng)變化趨勢一致。萜烯類揮發(fā)物為針葉樹的特征氣味化合物，對天牛、象甲和小蠹科的昆蟲具有良好的引誘作用[22]，但是對斑鞘豆葉甲表現(xiàn)為驅(qū)避作用，這可能由于該害蟲以大豆為寄主植物，健康大豆植株揮發(fā)物中不含萜烯類化合物。同樣發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲 Helicoverpa armigera和褐飛虱 Nilaparvata lugens分別對非寄主植物的檸檬烯和崁烯具有明顯的驅(qū)避反應(yīng)[23,24]，可見這類化合物的結(jié)構(gòu)和功能團與寄主植物揮發(fā)物差異較大，可被昆蟲嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)中專門的感器神經(jīng)元所感受，做出響應(yīng)，被鑒定為不適寄主，從而產(chǎn)生躲避反應(yīng)[25]。這在嗅覺神經(jīng)生理的研究中得到進一步證實，試驗發(fā)現(xiàn)云杉八齒小蠹 Ips typographus中有25%的嗅覺感受神經(jīng)元對非寄主揮發(fā)物有反應(yīng)，使小蠹避開不適宜寄主[20]。在6種萜烯類化合物中，斑鞘豆葉甲對(1R)-(+)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、(R)-(+)-檸檬烯和 β-月桂烯 EAG反應(yīng)較強，且具有顯著的驅(qū)避反應(yīng)，在低濃度下也具有較強的驅(qū)避作用，可作為驅(qū)避劑組分應(yīng)用于斑鞘豆葉甲的生物防控。另外，試驗發(fā)現(xiàn)從10-2mol/L增加到10-1mol/L，(1R)-(+)-α-蒎烯和(-)-β-蒎烯對斑鞘豆葉甲EAG反應(yīng)強度反而降低，(-)-β-蒎烯和β-月桂烯的驅(qū)避作用減弱。這種隨著揮發(fā)物濃度增加昆蟲嗅覺反應(yīng)受到抑制的現(xiàn)象在其他昆蟲的研究中也有發(fā)現(xiàn)。如褐飛虱對低濃度芳樟醇表現(xiàn)為引誘，高濃度下為驅(qū)避[26]；華北大黑鰓金龜對高濃度肉桂醛、芳樟醇、苯甲醇無趨向反應(yīng)，降低濃度時，對三種揮發(fā)物的選擇反應(yīng)率超過60%[13,14]?？梢娎ハx嗅覺感受神經(jīng)元對揮發(fā)物具有一定的濃度反應(yīng)閾值，在閾值范圍內(nèi)，表現(xiàn)為濃度行為效應(yīng)，當超過一定濃度則反應(yīng)受到抑制[27]。因此在驅(qū)避劑田間應(yīng)用時也要考慮揮發(fā)物的濃度問題。

斑鞘豆葉甲對醇類和醛類揮發(fā)物的 EAG反應(yīng)較強，行為試驗結(jié)果表明這些揮發(fā)物對斑鞘豆葉甲均有引誘作用，它們?yōu)槎鄶?shù)植物所釋放，具有廣譜性，并且在結(jié)構(gòu)上與斑鞘豆葉甲寄主大豆揮發(fā)物中的幾種醇、醛類化合物相似，這種相似的化合物功能團可能有利于斑鞘豆葉甲觸角氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合從而引起神經(jīng)沖動，做出反應(yīng)[28,29]。因此釋放這類化合物的非寄主植物也會吸引它們?nèi)∈?，并且未來在食物缺乏時可能在這些非寄主上定殖危害。比較斑鞘豆葉甲雌、雄蟲對該類揮發(fā)物的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，雌蟲對反-2-己烯醛、反-2-己烯-1-醇和2-乙基-1-己醇三種綠葉氣味揮發(fā)物的EAG反應(yīng)相對值均顯著高于雄蟲，引誘作用也強于雄蟲，這表明雌蟲觸角對綠葉氣味揮發(fā)物的響應(yīng)強于雄蟲。斑鞘豆葉甲的觸角掃描電鏡研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)雌蟲指形感器數(shù)量明顯多于雄蟲，該感器在寄主植物檢測和選擇產(chǎn)卵場所中起著重要的作用[30]，由此可以推斷綠葉氣味化合物可能在斑鞘豆葉甲雌蟲產(chǎn)卵定位中起信號作用。

異戊酸乙酯等5種其他揮發(fā)物是多數(shù)植物的花和果實的氣味化合物[31,32]，斑鞘豆葉甲對這些揮發(fā)物均具有引誘反應(yīng)，且雄蟲反應(yīng)強于雌蟲。研究發(fā)現(xiàn)許多昆蟲對這類化合物都表現(xiàn)為引誘反應(yīng)。如異戊酸乙酯對李象鼻蟲Conotrachelus nenuphar具有吸引作用[33]，乙酸葉醇酯吸引小綠葉蟬Empoasca flavescens取食[34]，桉葉素能夠顯著引誘馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaea operculella成蟲產(chǎn)卵[35]。這類揮發(fā)物的引誘作用可能源于具有的芬芳氣味，暗示花的存在，引導(dǎo)昆蟲取食花蜜，補充糖分[36,37]。而且在昆蟲觸角感器上有特定的氣味結(jié)合蛋白與這些化合物相互作用，實現(xiàn)寄主定位，滿足昆蟲獲取糖原的需求[38]。水楊酸甲酯既是植物揮發(fā)物，同時作為植物防御信號分子可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生次生代謝化合物[39]，研究發(fā)現(xiàn)大豆蚜Aphis glycines和二點葉螨Tetranychus urticae等危害后誘導(dǎo)植株釋放大量的水楊酸甲酯，對瓢蟲、草蛉和食蚜蠅等具有明顯的吸引作用，顯著增加田間天敵昆蟲的種群數(shù)量[40-42]。但水楊酸甲酯對斑鞘豆葉甲產(chǎn)生了明顯的誘引作用，銅綠麗金龜和玉米根葉甲Diabrotica virgiferea等昆蟲也對水楊酸甲酯表現(xiàn)出引誘反應(yīng)[43,44]。這表明蚜蟲等刺吸類害蟲危害后釋放的水楊酸甲酯可能是對后續(xù)其他昆蟲定殖提供了寄主植物適合度增強的信號，從而招引大量咀嚼式口器昆蟲取食和產(chǎn)卵，但是對一些蚜蟲、薊馬和葉蟬等昆蟲則產(chǎn)生了排斥作用[45-47]。

由于昆蟲在自然環(huán)境中，面臨著豐富而復(fù)雜的嗅覺信息，它們的嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)進化的更加復(fù)雜和精細，可以通過探測非寄主特定化合物或者化合物組分比例與正常寄主的差異來調(diào)整行為反應(yīng)[19]。因此，利用非寄主揮發(fā)物進行斑鞘豆葉甲的生物防控，還需要進行多組分揮發(fā)物綜合作用的檢測和田間效果評估。