富氫水緩解5-FU誘導(dǎo)的大鼠口腔粘膜潰瘍

張單雅 薛俊莉 劉伯言 陶鴿如 石運(yùn)芝 秦樹存

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）1.口腔醫(yī)學(xué)院；2.生命科學(xué)研究中心，山東泰安 271000

化療藥物引起的口腔粘膜潰瘍（oral mucosal ulcer，OMU）是一種常見的化療不良反應(yīng)［1］。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是一種抗代謝藥物，被用于乳腺、頭頸部和消化道等多種腫瘤的治療，以5-FU為基礎(chǔ)治療手段的患者中約有40%會(huì)出現(xiàn)OMU，臨床上以對(duì)癥治療為主，尚無高效穩(wěn)定的治療措施［2］。氫分子（molecular hydrogen，H2）是一類新型細(xì)胞抗氧化劑，其抗氧化、抗炎、抗凋亡的生理醫(yī)學(xué)效應(yīng)已在超過100種疾病模型中證實(shí)［3-4］。研究表明，氫分子在多種腫瘤放化療中起到明顯的減毒增效作用［5-6］。深入探討氫分子對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶引起OMU局部組織學(xué)、免疫學(xué)指標(biāo)的影響等，將為臨床應(yīng)用富氫水來改善放化療副作用，提高患者生存質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與取材

28 只健康雄性SD 大鼠，體重180 ～ 200 g（山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為5組。NaOH 顆粒 + 富氫水（A-H）組（n=6）：連續(xù)2 日給予實(shí)驗(yàn)大鼠 5-FU（0.05 mg/g，Sigma-Aldrich #F6627）腹腔注射［7-8］，第3 日用 2 ～ 3 粒 NaOH 顆粒，放置于左側(cè)頰部粘膜，放置時(shí)間約2 min后取出，第5日開始，晚間約19∶00 從密封桶中接富氫水（泰山岳溪泉飲有限公司灌制）至飲水瓶飼喂大鼠，早9∶00開始停水，保證大鼠飲用到氫氣濃度較高的富氫水；NaOH 顆粒+普通純凈水（A-N）組（n=6）：造模方法同A-H組，給予實(shí)驗(yàn)大鼠普通純凈水，飼喂時(shí)間與富氫水組相同；20%乙酸+富氫水（B-H）組（n=6）：連續(xù)2日給予實(shí)驗(yàn)大鼠5-FU 腹腔注射，第3 日將15 μL 20%乙酸注射于左側(cè)頰部粘膜下層，進(jìn)針角度約20°，第5 日開始，給大鼠飼喂富氫水，方法同A-H 組；20%乙酸+普通純凈水（B-N）組（n=6）：造模方法同BH組，給予實(shí)驗(yàn)大鼠普通純凈水，飼喂時(shí)間與富氫水組相同；健康對(duì)照（C）組（n=4），給予實(shí)驗(yàn)大鼠普通純凈水，飼喂時(shí)間同其他實(shí)驗(yàn)組。使用50 μm玻璃針狀氫傳感器（Unisense，Aarhus，丹麥）測(cè)定灌裝富氫水中氫氣的含量，接取的富氫水在5 h 內(nèi)可保證氫氣濃度≥1 ppm。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中統(tǒng)計(jì)存活率。第10日，采用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，觀察口腔粘膜損傷情況，拍照記錄，并使用Image J軟件測(cè)量潰瘍面積。采集下腔靜脈血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將大鼠安樂死后，切取大鼠左?cè)頰囊潰瘍處組織，4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟切片（5 μm），用于HE染色和免疫組織化學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)獲得山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA檢測(cè)

采用生物素雙抗體夾心ELISA 法測(cè)定標(biāo)本中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6、IL-1β 的水平，檢測(cè)試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供，操作步驟按說明書進(jìn)行，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀（infinite F200）即刻測(cè)量450 nm波長(zhǎng)的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)吸光度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，然后計(jì)算出樣品濃度。

1.3 免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，放入枸櫞酸緩沖液內(nèi)，微波抗原修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫后雙蒸水沖洗，滴加3%H2O2室溫孵育5 min，PBS沖洗。分別滴加兔抗TNF-α（1∶200，MyBiosource，MBS820357）、兔抗IL-6（1∶200，MBS2564633）和兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS，1∶200，MBS3000624），37 ℃孵育2 h，PBS 沖洗。滴加羊抗兔IgG/HRP 聚合物，室溫孵育 20 min，PBS 沖洗。DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照切片以PBS 代替一抗。DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 組織病理分析

肉眼觀察，與對(duì)照組相比，基于5-FU 與20%乙酸或NaOH 顆粒均可造成口腔頰部粘膜炎性損傷，表現(xiàn)為頰部粘膜損傷區(qū)形成直徑約3 ～8 mm 的圓形或橢圓形潰瘍，表面有厚約1 ～3 mm的灰白色假膜覆蓋，周圍黏膜充血、腫脹甚至出血（圖1A）。撕脫白膜后，可見火山口樣潰瘍（圖1B）。

圖1 大鼠口腔潰瘍模型，20%乙酸模型組，頰粘膜表面覆蓋一層可撕脫白膜（A），撕下可見粘膜紅腫破潰（B）

顯微鏡下觀察，正常大鼠頰粘膜表面被覆角化的復(fù)層鱗狀上皮，固有層為致密結(jié)締組織，富含血管，上皮釘突較短（圖2A，2B）。NaOH 顆粒模型組表層可見大量的壞死、出血和滲出，其下組織中含有大量中性粒細(xì)胞和增生的成纖維細(xì)胞（圖2C，2D）。乙酸模型組也表現(xiàn)為粘膜的壞死、出血和滲出，甚至累及肌層的表面（圖2E），部分飲用富氫水組的粘膜損傷較輕微，表現(xiàn)為上皮釘突反應(yīng)性增生和固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2F）。

圖2 大鼠口腔頰粘膜病理學(xué)觀察

檢測(cè)結(jié)果顯示，飲用富氫水可提高實(shí)驗(yàn)組大鼠存活率（P＜ 0.05）（圖3A）。NaOH 及乙酸造模組的2 組大鼠，在第11 日時(shí)的存活率為66%（4/6），而飲用富氫水的2 組大鼠沒有發(fā)生死亡，存活率為100%（6/6）。對(duì)于潰瘍面積，NaOH 顆粒制造的潰瘍，損傷面積大于注射20%乙酸造成的潰瘍損傷（圖3B）。NaOH 造模的實(shí)驗(yàn)組中，飲用富氫水組的潰瘍面積小于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；乙酸造模的實(shí)驗(yàn)組中，富氫水組和模型組潰瘍面積相近。

圖3 富氫水抑制大鼠口腔潰瘍動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，飲用富氫水可提高實(shí)驗(yàn)組大鼠存活率（A），而潰瘍組織假膜面積無明顯差異（B）

2.2 大鼠血清中ELISA檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子的含量處于正常水平。模型組大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β含量均高于對(duì)照組，而富氫水組較模型組均有降低的趨勢(shì)，但僅B-N 組IL-1β 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平（pg/mL）

2.3 頰粘膜免疫組化結(jié)果

顯微鏡下，免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色，陰性對(duì)照不著色。TNF-α在健康對(duì)照組中的表達(dá)最弱，陽性著色主要見于各實(shí)驗(yàn)組大鼠上皮細(xì)胞和炎性間質(zhì)中（圖4A）。以乙酸造模的實(shí)驗(yàn)組為例，B-N組炎性細(xì)胞高表達(dá)TNF-α（圖4B），B-H組僅上皮棘層細(xì)胞表達(dá)TNF-α，固有層著色淺（圖4C）；IL-6陽性著色部位與表達(dá)模式與TNF-α相似（圖4D ～4F）。iNOS在實(shí)驗(yàn)組頰粘膜中的陽性表達(dá)均較少（圖4G ～4I）。以上結(jié)果說明，飲用富氫水有效降低了大鼠頰部粘膜的炎癥水平。

圖4 大鼠頰粘膜免疫組織化學(xué)染色

3 討 論

化療藥物引起的OMU 嚴(yán)重影響了化療患者的生活質(zhì)量［9］。本研究基于大鼠OMU模型，探究了氫分子對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的OMU 的緩解作用。結(jié)果顯示，飲用富氫水可有效提高乙酸損傷誘導(dǎo)OMU大鼠的存活率（由66%提升至100%），降低大鼠系統(tǒng)性炎癥與頰部粘膜的炎癥，具有明顯的OMU 緩解作用，為進(jìn)一步應(yīng)用氫分子作為口腔炎癥疾病的輔助治療手段提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

OMU 現(xiàn)有的治療方法以減輕疼痛、促進(jìn)潰瘍愈合和延長(zhǎng)復(fù)發(fā)間歇期為目的，如補(bǔ)充缺少的微量元素、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、使用免疫增強(qiáng)藥等［7，10-12］。但這些藥物尚具有局部用藥不便、有效成分及副反應(yīng)不明確等缺陷。氫分子作為一種安全、容易獲取的新型抗氧化劑，通過有選擇性地降低羥自由基（·OH）和亞硝酸陰離子（ONOO－），保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷［13］。近年來，氫分子的選擇性抗氧化作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，并因其高度的安全性，被認(rèn)為是具有巨大潛力的“穩(wěn)態(tài)平衡劑”［14］。氫分子對(duì)皮膚損傷、口腔上顎創(chuàng)傷、化療引起的器官損傷均具有顯著的保護(hù)作用［15-17］。研究表明，吸入1%的氫氣或飲用富氫水能夠減輕小鼠由順鉑引起的腎臟損傷，緩解腎臟的細(xì)胞凋亡，血清肌酐和尿素氮水平均有所下降［18］。Meng等［19］證實(shí)，在順鉑誘導(dǎo)的大鼠卵巢損傷模型中，注射富氫生理鹽水能夠促進(jìn)卵泡發(fā)育趨向規(guī)律，減輕各級(jí)卵泡皮層的損傷，具有明顯的卵巢保護(hù)作用。此外，一項(xiàng)包含152 例接受mFOLFOX6 化療的結(jié)直腸癌患者的隨機(jī)單盲臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)飲用富氫水對(duì)mFOLFOX6引起的肝損傷具有保護(hù)作用［20］。

我們的研究中，富氫水組的大鼠系統(tǒng)性炎性因子水平與頰粘膜局部的炎癥因子表達(dá)均有所下降，這可能與氫分子抑制氧化應(yīng)激對(duì)黏膜的直接損傷和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而減少系統(tǒng)性TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等促炎因子的表達(dá)有關(guān)［21］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突