活血軟堅通絡(luò)方對大鼠冠脈微血管血栓及內(nèi)皮損傷因子水平的影響

張 萌 李 明 張 莉 張 明 苗 鑫 李元民

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東泰安 271000

微血管病變的研究隨科技發(fā)展不斷深入，心臟作為有節(jié)律的泵血器官，其微血管的研究較其他器官更加復(fù)雜。冠脈微血管功能障礙是微血栓形成、微血管痙攣、內(nèi)皮炎癥、肌源性收縮等多方面因素導(dǎo)致的［1］。中醫(yī)認(rèn)為病變部位在心之絡(luò)脈，吳以嶺等人［2］提出“孫絡(luò)-微血管”概念，總結(jié)中醫(yī)病機：心氣虧虛，心絡(luò)脈瘀滯不通，采用通絡(luò)活血治療取得顯著療效。本研究采用向大鼠左心室注射月桂酸鈉建立冠脈微血管血栓及內(nèi)皮損傷動物模型，給予自擬活血軟堅中藥進行干預(yù)，通過觀察大鼠心肌病理損傷修復(fù)、微血管血栓及血清中內(nèi)皮損傷相關(guān)的檢測指標(biāo)前列腺素I2（PGI2）、血栓素A2（TXA2）變化情況，探討中藥方對冠狀動脈微血管病變的相關(guān)作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物為濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供的Wistar 雄性大鼠，7 周齡，體重（221 ± 30）g，動物許可證號：SCXK（魯）20190003。飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心病理動物室，觀察生命體征1周后實驗開始。

1.2 實驗藥品和試劑

1.2.1 觀察藥物 活血軟堅中藥由黃芪15 g、川芎5 g、地龍5 g、桃仁5 g、牡蠣15 g、荔枝核10 g、土鱉蟲5 g、澤瀉5 g 等組成。本方以中醫(yī)經(jīng)典方補陽還五湯加減而成，中藥飲片購于山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，由藥劑科加工成4 g/mL的濃縮劑。

1.2.2 對照西藥 尼可地爾片，規(guī)格5 mg，天方藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H41024517。

1.2.3 ELISA 試劑盒（上海酶免生物科技有限公司），實驗用月桂酸鈉粉劑（十二酸鈉）（武漢富鑫遠科技有限公司），注射用戊巴比妥鈉0.1 g（上海國藥有限公司），肝素鈉注射液2 mL：12 500 iu（昆明積大制藥有限公司），注射用青霉素鈉粉劑0.48 g（80萬單位）（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 實驗器材

1.3.1 實驗器械 3K30 高速離心機（德國Sigma公司），超低溫－80 ℃冰箱（中科美菱低溫科技有限公司），小動物呼吸機（ALC-V8型動物呼吸機，江蘇賽昂斯生物科技有限公司），電子秤臺秤（北京京衡偉業(yè)科技有限公司），灌胃針（規(guī)格：16 號，8 cm，北京中昊萬通科技有限公司），高精度天平（梅特勒-托利多公司，AB265-S），光學(xué)顯微鏡及圖像觀察系統(tǒng)。

1.3.2 其他器械及輔料 氣管插管套管，眼科直剪，蚊氏止血鉗，巾鉗，開胸器，大鼠實驗解剖臺，鑷子，手術(shù)刀片，彎剪，直剪，防凝管，縫針，量筒，小針刀，皮拉鉤，吸引器，0.1 mL安全注射器，20 mL注射器，無影燈等。棉簽、棉球、無菌紗布、繃帶、膠布、5%碘伏、75%酒精、乙醇、骨蠟、0.9%生理鹽水、蒸餾水（山東第一醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室提供）。

1.4 造模方法

根據(jù)冠狀動脈微血管病變動物建模方法評估［3-4］選用向左心室注射月桂酸鈉法造模，造模處理過程［5］：選擇造模組大鼠逐個稱重并記錄，根據(jù)體重給予戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）麻醉，麻醉成功后，動物解剖臺固定四肢，剃毛備皮后碘伏3次消毒，選擇大鼠頸部正中偏下切開皮膚，注意保護動脈，逐層分離直至暴露大鼠氣管，給予氣管插管操作，檢測氣管插管成功后，迅速連接小動物呼吸機通氣。待呼吸節(jié)奏平穩(wěn)后，選擇大鼠左胸部第2～3肋間，再次消毒，沿胸骨左緣縱向切開皮膚，鈍性分離肌肉，大范圍暴露左側(cè)肋骨，利用咬骨鉗精準(zhǔn)剪斷第2、3、4、5 肋，充分暴露大鼠心臟、主動脈，保護心臟附近走行神經(jīng)助手觀察主動脈升部以及弓部，施術(shù)者用小動物開胸器將大鼠胸腔左右擴開并固定，暴露心尖部，將微量注射器沿心尖部刺入左心室，迅速打入已配置的月桂酸鈉SL（1 mg·kg－1），注射完成后助手迅速夾住主動脈升部與弓部連接處10 s，間斷夾持，使SL沿主動脈起始部流入冠狀動脈。完成SL注射操作后將心臟放回，觀察心臟搏動情況，待搏動平穩(wěn)后，胸腔注射0.1 mL青霉素再逐層縫合。待呼吸心跳平穩(wěn)10 min后拔除氣管插管。術(shù)后3天常規(guī)給予青霉素40萬單位腹腔注射預(yù)防感染，動物清醒后入籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組手術(shù)方式與造模組相同，但不注入月桂酸鈉。術(shù)后3 d連續(xù)肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

1.5 分組及給藥

將60 只健康Wistar 大鼠按隨機數(shù)字表法隨機抽出假手術(shù)組15 只，余為造模組45 只。造模組行SL注入左心室造模，非造模組行假手術(shù)。將已造模成功的大鼠利用隨機數(shù)字表法再隨機進行分組。尼可地爾組、中藥組在造模成功后第2 天開始藥物干預(yù)，分別給予尼可地爾1.5 mg·（kg·d）－1、活血軟堅中藥15 g·（kg·d）－1灌胃，假手術(shù)組、模型組給予同等劑量蒸餾水灌胃，每日1次；實驗劑量采用大鼠的臨床等效劑量換算而成。

于造模后第28天，將大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，各組大鼠腹主動脈取血，并處死取心臟，動脈血立即離心（3600 r·min－1，10 min），分離血清，分裝密封，保存?zhèn)溆?。心臟另行切片、固定，保存?zhèn)溆?。實驗整個過程及動物處死均符合實驗動物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 實驗指標(biāo)及指標(biāo)測定

1.6.1 心肌蘇木素-伊紅（HE）染色 將心臟沿縱軸切開，取需要染色心肌標(biāo)本，各濃度酒精反復(fù)脫水，二甲苯浸泡透明，浸蠟包埋，自動切片機切片，脫蠟并心肌蘇木素-伊紅染色，再行各梯度酒精脫水、透明固封［6］。

1.6.2 將所取標(biāo)本沿心臟長軸切開，取2 mm厚心肌切塊，甲醛固定并染色，在光鏡下以視野（×100）隨機觀察直徑≤100 μm的冠脈微血管［5］，統(tǒng)計微血栓堵塞的血管數(shù)占所觀察微血管百分率，評估微血管阻塞情況。

目前，椎弓根螺釘已廣泛應(yīng)用脊柱骨折、椎間盤突出癥、椎管狹窄及脊柱腫瘤中。椎弓根置釘方法有很多，而術(shù)中導(dǎo)航為最準(zhǔn)確的[1]，但導(dǎo)航系統(tǒng)價格高昂，難以短期內(nèi)在更大范圍內(nèi)應(yīng)用。基層醫(yī)師因條件限制，術(shù)中往往憑經(jīng)驗、手感行椎弓根螺釘置入，其位置常常很難控制，甚至?xí)⒆倒┢?，其發(fā)生率為20～30%。我們在基層醫(yī)院常?？梢耘龅阶倒斨踩胧М?dāng)或誤置，引起骨折復(fù)位不佳、固定不穩(wěn)，甚至出現(xiàn)了許多諸如椎弓根螺釘穿破椎弓根、椎體，損傷血管、脊髓、神經(jīng)根等并發(fā)癥[2]。這些并發(fā)癥的發(fā)生不僅與手術(shù)者水平有關(guān)，還與椎弓根解剖結(jié)構(gòu)個體差異有關(guān)。

1.6.3 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測大鼠血清中PGI2、TXA2的水平。嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)注方法進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 模型建立情況

采用向大鼠左心室注射月桂酸鈉法致大鼠冠狀動脈微血管阻塞及內(nèi)皮功能損傷，共造模45只。造模過程中死亡2 只，存活43 只，假手術(shù)組手術(shù)死亡1 只。造模72 h 后分別抽取假手術(shù)組和造模組各2 只行心臟病理切片檢查及微血管觀察，結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠冠脈微血管未見明顯阻塞，心肌組織未見明顯病理改變；造模組大鼠冠脈微血管見不同程度阻塞，血管腔緊縮狹窄；阻塞微血管附近心肌細胞核固縮，染色質(zhì)聚集，細胞間緊密連接斷裂增寬。提示大鼠冠脈微血管阻塞模型造模成功。見圖1。

圖1 完成造模操作后72 h心肌病理切片（HE × 100）

將造模成功的41只大鼠隨機分為三組，模型組14 只，中藥組 14 只，尼可地爾組 13 只，以假手術(shù)組（12只）為對照組。

2.2 28天后各組大鼠心肌病理切片觀察

假手術(shù)組切片顯示：心肌冠脈微血管內(nèi)鏡下未見明顯栓塞，所觀察微血管范圍的心肌組織未見明顯缺血或纖維化等病理改變。模型組：冠脈微血管內(nèi)見粉紅色由血小板、纖維素和紅細胞等組成的微血栓形成，血管周圍心肌細胞核聚集，心肌纖維斷裂，排列紊亂，周圍有纖維組織增生。尼可地爾組：所觀察微血管病理變化較模型組相似，對比之后發(fā)現(xiàn)微血管阻塞數(shù)目、微血管內(nèi)血栓阻塞程度及所觀察微血管范圍內(nèi)相關(guān)心肌損傷、心肌纖維增生等病理變化較模型組變化明顯。中藥組：病理與模型組相似，在微血栓栓塞及心肌損傷方面有明顯改善，但較尼可地爾組相比血管阻塞改善不明顯。見圖2。

圖2 28天后各組大鼠心肌病理切片觀察（HE × 100）

2.3 28天后各組大鼠冠狀動脈微血管血栓阻塞情況觀察及數(shù)目

光鏡下觀察假手術(shù)組未見有明顯符合條件的微血管。模型組：視野下栓塞微血管數(shù)目較多，且大部分血管阻塞≥50%。尼可地爾組：視野下栓塞微血管數(shù)目及血管阻塞情況較模型組有明顯改善。中藥組：視野下栓塞微血管數(shù)目及血管阻塞情況較模型組有改善，但弱于尼可地爾組。見圖3。

圖3 28天后各組大鼠冠狀動脈微血管血栓阻塞情況觀察（HE × 100）

表1 28天后四組大鼠微血栓堵塞血管率（，%）

表1 28天后四組大鼠微血栓堵塞血管率（，%）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與模型組比較，bP ＜ 0.05。

n 12 14 14 13組別假手術(shù)組模型組尼可地爾組中藥組微血栓阻塞血管率0 35.84±2.04 19.03±1.18a 20.01±1.35b 1435.451＜0.001 F P

2.4 大鼠血清PGI2及TXA2水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清PGI2明顯減少（P＜ 0.01），TXA2明顯升高（P＜ 0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠血清PGI2明顯升高（P＜ 0.01），TXA2明顯減少（P＜ 0.01）；與尼可地爾組比較，中藥組血清PGI2及TXA2未見明顯改變（P＞ 0.05）。結(jié)果見表2。

表2 28天后各組大鼠血清PGI2、TXA2水平（ ng/L）

表2 28天后各組大鼠血清PGI2、TXA2水平（ ng/L）

注：與假手術(shù)組比較aP ＜ 0.01；與模型組比較：bP ＜ 0.01。

組別假手術(shù)組模型組尼可地爾組中藥組TXA2 6.91±0.30 16.28±0.71a 9.35±0.58b 9.79±0.52b 632.701＜0.001 n 12 14 14 13 F P PGI2 35.38±1.47 22.02±1.06a 47.83±1.07 47.00±0.93b 1420.662＜0.001

3 討 論

冠狀動脈疾病主要涉及冠脈通道動脈及冠脈微血管，冠脈通道動脈的狹窄已被PCI 有效解決，但PCI 術(shù)后或未曾手術(shù)而造成的無復(fù)流、慢血流現(xiàn)象仍然困擾著研究者，因此冠脈微血管病變也就成為研究的重點。冠脈微血管病變的多種臨床表現(xiàn)、不能被廣泛認(rèn)可的治療方案以及治療效果的不確定性源于對其發(fā)病機理認(rèn)識的不足和現(xiàn)代藥物發(fā)揮臨床作用的局限性。冠狀動脈微血管病變的流行病學(xué)研究提示冠脈小動脈的復(fù)雜多樣的調(diào)節(jié)機制存在空間分布的異質(zhì)性［7］。即使在正常冠脈血流情況下，微血管舒張/收縮在空間分布中也是不一致的，這種現(xiàn)象表明冠脈微血管的調(diào)節(jié)存在廣泛的、復(fù)雜的、與代謝密切相關(guān)的機制。微血管栓塞被認(rèn)為是冠脈微血管慢血流的主要原因［8］。除去手術(shù)人為因素造成血栓阻塞外，內(nèi)皮炎癥反應(yīng)是引起微血管栓塞的主要因素［9-10］，PGI2和TAX2作為參與微血管血栓形成的炎癥因子，可代表內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的輕重。有研究表明，冠脈微血管病變，PGI2減少，TAX2升高［11］。

在實驗造模選擇方面，因冠脈微血管病變病理機制的復(fù)雜性，現(xiàn)在尚沒有一個能夠代表各種病理機制的理想動物模型。據(jù)各種造模的報道，對不同的病理機制在模型選擇上亦有一定傾向性，有學(xué)者［3］選擇自制微顆?；蜃泽w血栓作為血管阻塞模型，但無法模擬內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的病理過程。本實驗選擇月桂酸鈉造模法，據(jù)沈成興等人［4］實驗表明，注射月桂酸鈉可引起冠脈微血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，造成血管血栓阻塞。注射月桂酸鈉1 h后即引起的微血栓，72 h 后達到穩(wěn)定狀態(tài)，故選擇造模完成72 h 后行心肌病理檢查。到目前為止在臨床治療過程中，仍然沒有一種確定的藥物被證實對冠脈微血管病變普遍有效，但部分藥物在冠脈微血管病變的某些方面已確定療效，有研究報道，開放鉀離子通道藥尼可地爾能改善血管內(nèi)皮功能，擴張微血管，調(diào)節(jié)纖溶活性，但并沒有減少心肌梗死面積［12-13］。

中醫(yī)歷代文獻中并沒有微血管的相關(guān)概念，但根據(jù)臨床癥狀記載散見于“心痛”、“胸痹”、“虛里痛”等中，張仲景首開絡(luò)脈治療先河，應(yīng)用旋復(fù)花湯、大黃蟅蟲丸治療肺絡(luò)、胞宮絡(luò)病變，及至清朝葉天士重用蟲類藥物治療絡(luò)脈疾病，為后世應(yīng)用蟲類藥物治療積累了豐富的經(jīng)驗。自吳以嶺［2］提出絡(luò)病“孫絡(luò)-微血管”病理概念，明確冠脈微血管在中醫(yī)上屬于心之絡(luò)脈，中醫(yī)治療絡(luò)病積累了豐富的經(jīng)驗，總結(jié)臨床主要治療經(jīng)驗，歸納心絡(luò)脈病變的主要病機為：血瘀、痰結(jié)、絡(luò)積［14-15］。吳以嶺等人［2］應(yīng)用活血通絡(luò)法進行治療取得良好療效。有學(xué)者報道，應(yīng)用活血通絡(luò)的補陽還五湯可改善冠心病PCI術(shù)后癥狀［16］。劉琪等人［17］報道運用軟堅散結(jié)法進行治療效果明顯。本次實驗所選活血軟堅中藥是在補陽還五湯基礎(chǔ)上結(jié)合吳以嶺通心絡(luò)的蟲類藥物用藥經(jīng)驗加入牡蠣、荔枝核軟堅散結(jié)藥物組成。其中黃芪為君藥補養(yǎng)元氣，川芎、土鱉蟲為臣藥活血散瘀，桃仁、當(dāng)歸、牡蠣、荔枝核為佐藥，地龍為使藥，引諸藥入絡(luò)脈而發(fā)揮通絡(luò)散結(jié)作用。諸藥合用共同作用于心之絡(luò)脈，活血瘀、逐痰凝、通絡(luò)脈。

本研究發(fā)現(xiàn)，用藥28 d 后，活血軟堅中藥可減輕微血管栓塞及增加PGI2，減少TAX2，在改善微血管血流及減輕心肌損傷方面有明確的作用。與尼可地爾組比較，活血軟堅中藥未見明顯優(yōu)勢，其可能原因為：①中藥組對于冠脈微血管栓塞及內(nèi)皮損傷發(fā)揮作用可能是多維度的，與尼可地爾單一機制不同，本次選取微血管栓塞及損傷因子PGI2、TXA2尚不足以全面反映中藥方的作用機制；②中藥組可能需要更長時間才能改善冠脈微血管病變。

另外，本研究在對心肌進行病理檢查時發(fā)現(xiàn)利用月桂酸鈉造模在同一只大鼠冠脈微血管的不同部位，血管損傷亦有很大的區(qū)別。在損傷微血管附近的心肌病理改變也呈現(xiàn)出不同程度的差異性，有的以血管炎癥反應(yīng)為主，有的以心肌壞死纖維化為主。上述兩點亦反映了在冠狀動脈微血管病變機制上的復(fù)雜性。與尼可地爾主要改善微血管血栓阻塞作用不同，中藥方對冠脈微血管病變的血栓、心肌損傷等諸方面均有作用，這也進一步證實中藥方多靶點、多層次作用機制。以本次研究為基礎(chǔ)，后期我們會重點研究造成冠脈微血管病變多種機制之間的相關(guān)聯(lián)系，以期待能闡明某種條件下的確定性的病變機理及治療方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突