Nrf2激活劑CDDO-EA抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)功能損傷及促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型轉(zhuǎn)化

董其威 趙華陽 任世浩 張朋杰 侯亞軍 毛蕾蕾

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）生命科學(xué)研究中心，山東省高校腦微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是由于腦底部或腦表面病變血管破裂致血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔所引起的急性病癥，發(fā)病率僅次于腦梗死和高血壓性腦出血，位居腦血管病第三位，其死亡率高達(dá)35%，大部分的幸存者晚期會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能缺損等終身殘疾癥狀，具有高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)［1］。神經(jīng)炎癥損傷是SAH 后主要病理生理機(jī)制之一，SAH 發(fā)生后，局部小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）迅速激活，啟動(dòng)效應(yīng)物的釋放和外周炎癥細(xì)胞的募集。小膠質(zhì)細(xì)胞具有較高的可塑性，在響應(yīng)微環(huán)境觸發(fā)時(shí)可以呈現(xiàn)截然相反的功能表型。一種表現(xiàn)型是“經(jīng)典激活型”M1 型，釋放破壞性的促炎介質(zhì)；另一種表型是“選擇性激活”抗炎M2 表型，與神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)［2-3］。最近的研究表明，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型的極化可能是SAH后腦保護(hù)的重要治療策略。

最近的研究表明，氧化還原相關(guān)的核因子2 相關(guān)因子（Nrf2）的激活有助于促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后向M2 表型轉(zhuǎn)化?；罨腘rf2 易位到細(xì)胞核，并與氧化應(yīng)激細(xì)胞中的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，從而觸發(fā)抗氧化和抗炎基因的轉(zhuǎn)錄及其下游轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達(dá)［4-5］。CDDO-EA及其類似物來源于齊果酸，已被證明在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中均可激活Nrf2信號(hào)，表現(xiàn)出抗炎和抗氧化活性［6］。CDDO-EA具有較好的生物利用度，能有效穿透小鼠血腦屏障。然而，尚不清楚CDDO-EA 是否可通過激活Nrf2影響小膠質(zhì)細(xì)胞極化，并進(jìn)而影響SAH 后神經(jīng)炎癥反應(yīng)，達(dá)到改善神經(jīng)功能的作用。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠大腦中動(dòng)脈穿刺法制作SAH模型，探討CDDO-EA 對(duì)SAH 后神經(jīng)功能及小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑

C57BL/6 小鼠（22～25 g）購自于山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，CDDO-EA購自于MedChemExpress公司，Nrf2單克隆抗體及β-actin一抗購自于Abcam公司，CD16 及CD206 一抗分別來源于BD Biosciences（553142）和R&D Systems（AF2535）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

選取50 只小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、SAH + PBS 組、SAH + CDDO-EA（10 μg、50 μg 、100 μg）5 組。應(yīng)用大腦中動(dòng)脈穿刺法制作 SAH 模型，術(shù)后48 h處死后取大腦皮層行Western blot評(píng)價(jià)Nrf2表達(dá)水平。隨后選取最佳劑量50 μg作為治療劑量，將30 只動(dòng)物隨機(jī)分為Sham、SAH + PBS 組、SAH+CDDO-EA（50 μg）3組，術(shù)后72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后處死小鼠并留取腦組織進(jìn)行冰凍切片。

1.3 小鼠SAH模型制作

采用國(guó)際上公認(rèn)的血管內(nèi)穿刺法制作SAH 模型。小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后仰臥并固定。沿頸中線剪開頸部皮膚及肌肉層，暴露并分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，將6-0尼龍線插入頸外動(dòng)脈，隨后途經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，行經(jīng)約10 mm后尼龍線到達(dá)大腦中動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉處，感覺到阻力，繼續(xù)行進(jìn)2 mm 穿刺血管壁，10 s 后退出尼龍線并結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，最后縫合傷口并消毒。這種模型可造成Willis 環(huán)動(dòng)脈破裂出血，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔，可以很好地模擬臨床動(dòng)脈瘤破裂造成的蛛網(wǎng)膜下腔出血。Sham組手術(shù)時(shí)，僅暴露并分離血管即可，不做插線及穿刺。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

神經(jīng)功能缺損評(píng)分系統(tǒng)為修改的Garcia評(píng)分系統(tǒng)（表1），主要是對(duì)SAH后的神經(jīng)功能做整體評(píng)估。神經(jīng)功能缺損評(píng)分系統(tǒng)包括6項(xiàng)：自發(fā)性活動(dòng)、前爪伸展、四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性、攀爬、軀體感受、對(duì)刺激胡須的反應(yīng)，總分18分。評(píng)分含3個(gè)等級(jí)，3～6分代表重度神經(jīng)功能損傷，7～12 分代表中度神經(jīng)功能損傷，13～18分代表輕度神經(jīng)功能損傷。

表1 神經(jīng)功能評(píng)分系統(tǒng)

1.5 Western blot

將動(dòng)物麻醉后處死，在冰上留取特定部位的新鮮腦組織，冰浴下加組織裂解液勻漿，利用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后95 ℃水浴中變性5 min即為上樣標(biāo)本。制備SDS-PAGE分離膠，加樣后電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上，用2%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后二抗孵育2 h，洗滌后加ECL 顯色液，利用Bio-Rad ChemiDocTMMP 成像系統(tǒng)采集圖像，用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶的積分光密度值，以評(píng)估蛋白的表達(dá)量。

1.6 免疫熒光染色

本實(shí)驗(yàn)采用冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色。小鼠處死后經(jīng)灌注固定及脫水，OCT包埋切片25 μm。挑選腦片經(jīng)PBS 漂洗及透化、封閉后，放入稀釋好的一抗中，4 ℃孵育過夜，隨后放入驢來源二抗中孵育1 h，洗滌。若進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，重復(fù)以上封閉及一抗、二抗孵育步驟。最后封片并用激光共聚焦顯微鏡（Nikon）掃描圖像后進(jìn)行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Nrf2的表達(dá)

CDDO-EA 是一種NF-E2 相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件（Nrf2/ARE）激活劑，圖1A 為CDDO-EA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。我們給予小鼠腹腔注射不同劑量（10、50、100 μg/只）的CDDO-EA，48 h 后收集各組動(dòng)物大腦皮層做Western blot檢測(cè)CDDO-EA表達(dá)量。如圖 1B、C 和表 2 所示，與 PBS 對(duì)照組相比，50 μg 及100 μg 處理組腦內(nèi) Nrf2 表達(dá)量均明顯增加（P＜0.05）；50 μg與 100 μg處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖1 CDDO-EA處理可上調(diào)腦內(nèi)Nrf2的表達(dá)

表2 各組動(dòng)物大腦皮層Nrf2蛋白水平的表達(dá)（）

表2 各組動(dòng)物大腦皮層Nrf2蛋白水平的表達(dá)（）

注：與PBS組比較，aP ＜ 0. 05，bP ＜ 0. 001。

Nrf2 100±9.71 92.77±1189 118.12±4.66 130.25±11.21a 155.8±5.13b 15.44 0.0003組別假手術(shù)組（Sham）PBS CDDO-EA（10 μg）CDDO-EA（50 μg）CDDO-EA（100 μg）只數(shù)3 3 3 3 3 F P

2.2 SAH程度分級(jí)及神經(jīng)功能評(píng)分

如圖2A所示，術(shù)后24 h剝?nèi)〈竽X拍照，SAH組大腦顱底表面、Wilis環(huán)及腦干均有明顯的出血。根據(jù)出血情況，進(jìn)行SAH 程度分級(jí)評(píng)分，SAH + PBS 組與SAH + CDDO-EA 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明模型制作穩(wěn)定，如圖2B。術(shù)后72 h對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，如圖2C，SAH+PBS組神經(jīng)功能評(píng)分比Sham組明顯降低（P＜0.01），說明SAH小鼠有明顯的神經(jīng)功能障礙，而給予CDDO-EA治療后神經(jīng)功能有所改善（P＜ 0.05）。

圖2 CDDO-EA治療能明顯改善SAH后神經(jīng)功能損傷

2.3 M2型小膠質(zhì)細(xì)胞測(cè)定

術(shù)后72 h 對(duì)各組腦組織切片進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，見圖 3、4 及表 3，選用 Iba-1 標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，CD206 為M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。與Sham 組相比，SAH 術(shù)后皮層及海馬的CD206 +Iba1+M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞均有所增加（P＜ 0.05），說明SAH 能激活小膠質(zhì)細(xì)胞；CDDO-EA 治療后M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比Vehicle 對(duì)照組明顯增多，說明CDDO-EA 能促進(jìn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥及促進(jìn)吞噬碎片的功能。

表3 SAH后各組動(dòng)物大腦CD206+M2小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)（）

表3 SAH后各組動(dòng)物大腦CD206+M2小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)（）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01；與SAH+PBS 組比較，cP ＜ 0. 001。

海馬CA1區(qū)（%）2.86±0.08 19.85±5.95a 60.69±8.65c 74.35＜0.0001組別假手術(shù)組（Sham）SAH+PBS（Vehicle）SAH+CDDO-EA（EA）只數(shù)3 4 4 F P基底皮層區(qū)（%）8.57±1.43 27.18±4.30b 82.11±5.80 299.8＜0.0001

圖3 CDDO-EA治療可促進(jìn)SAH后大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型分化

3 討 論

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是SAH 后早期腦損傷的重要病理生理機(jī)制之一，與血腦屏障破壞、腦水腫及神經(jīng)元凋亡等級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，是導(dǎo)致SAH神經(jīng)功能受損的重要原因。大量研究表明，如果能有效調(diào)節(jié)SAH后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，則可在很大程度上抑制腦損傷，減少神經(jīng)行為及認(rèn)知功能障礙。炎癥機(jī)制已成為目前治療SAH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

在生理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是不活躍的，并與細(xì)胞質(zhì)中的CNC 同源相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合在kelch樣紅細(xì)胞衍生蛋白上［7-8］。氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2被Keap1激活釋放，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并與ARE結(jié)合，激活其下游Ⅱ期解毒酶、硫氧還蛋白和HO-1 基因的表達(dá)，從而引起細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用［9-10］。CDDO源自中國(guó)用于治療肝炎的齊墩果酸［11］，CDDO衍生物具有很強(qiáng)的抗癌、抗炎和抗氧化活性，如CDDO-IM（CDDO 咪唑酮）、CDDO-ME（CDDO 甲基酯）和CDDO-EA 等，是Nrf2 信號(hào)通路的有效激活劑［12］。本研究顯示，腹腔注射CDDO-EA確實(shí)能夠上調(diào)小鼠腦內(nèi)Nrf2 的表達(dá)。在本課題組之前的研究中發(fā)現(xiàn)CDDO-EA 能夠通過上調(diào)Nrf2 的表達(dá)有效抑制缺血性腦梗死模型后神經(jīng)炎癥反應(yīng)，但是CDDO-EA 對(duì)SAH 模型是否有治療作用尚未見有報(bào)道，本研究結(jié)果提示該藥物用于治療SAH 小鼠可以明顯改善術(shù)后神經(jīng)功能。

圖4 CDDO-EA治療可促進(jìn)SAH后大腦海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型分化

SAH 可誘發(fā)強(qiáng)烈的抗原特異性與非特異性的免疫反應(yīng)，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等對(duì)損傷作出快速反應(yīng)并遷移至損傷部位，盡管這些免疫細(xì)胞有助于清除血腫及組織修復(fù)，但是同時(shí)會(huì)釋放大量的促炎因子引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失［13-14］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病固有免疫反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)者，是一把雙刃劍，它具有M1和M2兩個(gè)極化表型，M1型通過釋放大量促炎性因子介導(dǎo)神經(jīng)元損傷及細(xì)胞凋亡；M2 型可釋放IL-10等抑炎因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子抑制神經(jīng)損傷，還可通過吞噬細(xì)胞碎片促進(jìn)神經(jīng)再生［15］。SAH 后以釋放促炎因子為特點(diǎn)的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，而以吞噬細(xì)胞碎片、血凝塊，促進(jìn)修復(fù)為主的M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞相對(duì)弱化，兩者具有同源性，在腦內(nèi)不容易被區(qū)分開［16-17］。先前的研究表明，Nrf2的激活可使小膠質(zhì)細(xì)胞的極化向抗炎M2表型轉(zhuǎn)變［18-19］。我們的研究結(jié)果顯示，SAH 術(shù)后皮層及海馬的CD206+Iba1+M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞均比Sham 組有所增加，說明SAH能激活小膠質(zhì)細(xì)胞；而CDDO-EA治療后M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞比Vehicle 對(duì)照組明顯增多，因此，本研究證實(shí)了CDDO-EA可通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化轉(zhuǎn)變。

綜上所述，CDDO-EA 可能通過上調(diào)Nrf2 的表達(dá)干預(yù)SAH后腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞極化類型，促進(jìn)其向抑炎促修復(fù)M2 型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而有效抑制過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能。本研究可能為CDDO-EA用于臨床治療SAH提供研究依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突