臨床HCV血清及其純化核酸在不同儲存條件下的穩(wěn)定性分析*

王嫣 王海濱 徐東平 許友山 夏衛(wèi)

丙型病毒性肝炎不僅是威脅人類健康的傳染病，而且也影響臨床的輸血安全。全球約有1.8億人口感染丙型肝炎病毒（HCV），且全世界范圍內(nèi)每年新感染HCV的患者高達(dá)10萬人[1-2]。HCV主要通過血液傳播，國外30%～90%輸血后肝炎為丙型肝炎，我國輸血后肝炎中有33%為丙型肝炎[1]。 HCV核酸檢測不僅能顯著縮短HCV篩查的窗口期，而且是臨床評價病毒復(fù)制水平及監(jiān)測治療效果的重要參考依據(jù)[3]。然而，HCV是一種高度變異的正鏈RNA黃病毒，離體后易受外界環(huán)境的影響引起RNA降解。在臨床或科研實(shí)踐中，樣本采集后經(jīng)運(yùn)輸和保存，甚至某些樣本被反復(fù)凍融后才檢測分析，這些過程均可導(dǎo)致病毒RNA發(fā)生降解，造成“窗口期”感染的漏檢，不僅威脅血液質(zhì)量安全，而且影響臨床醫(yī)生對患者體內(nèi)HCV水平的準(zhǔn)確評估。因此研究不同濃度HCV血清及其純化核酸在不同儲存條件下的穩(wěn)定性特點(diǎn)具有重大意義。

本文用血站HCV陰性獻(xiàn)血者血清作為稀釋液將臨床收集的107IU/mL HCV血清稀釋成105IU/mL、103IU/mL，探討臨床常見的高、中、低三種濃度HCV血清及其純化核酸隨時間、溫度（25 ℃、4℃、-20 ℃）的變化特點(diǎn)。

材料與方法

1 一般資料 樣本來源于2018年7月～2019年6月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心（原解放軍三O二醫(yī)院）確診為丙型病毒性肝炎患者58例，該院臨檢中心檢測血清抗HCV抗體均為陽性且HCV RNA載量為107IU/mL，診斷符合2004年公布的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。由該院的全軍傳染病研究所臨床研究管理中心收集血清于50 mL離心管-20 ℃凍存，忽略期間的降解，以實(shí)驗(yàn)稀釋后的濃度為實(shí)驗(yàn)的初始濃度。2019年5月～6月本站收集100例經(jīng)2次血清抗體檢查和1次核酸篩查后正常的獻(xiàn)血者血清作為本實(shí)驗(yàn)的稀釋液，干冰保存運(yùn)輸至全軍傳染病研究所臨床研究管理中心，并由該實(shí)驗(yàn)室開展3種不同濃度HCV血清及其純化核酸隨時間、溫度（25 ℃、4 ℃、-20℃）變化特點(diǎn)的研究。

2 儀器與試劑 儀器采用上海宏石SLAN 96P熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀，Qiagen RNA病毒提取試劑盒、Qiagen RNA病毒純化試劑盒、HCV核酸定量檢測試劑盒均購自凱杰生物工程（深圳）有限公司。

3 方法

3.1 標(biāo)本前處理：臨床收集50 mL HCV RNA載量為107IU/mL血清作為第一份血清，血站收集的兩份50 mL HCV陰性血清作為實(shí)驗(yàn)稀釋液，從第一份血清中取0.75 mL加到50 mL陰性血清中，充分混勻后制成第二份血清，再從第二份血清取0.75 mL加入另一份50 mL陰性血清中，充分混勻制成第三份血清。等量倍比稀釋后經(jīng)PCR定量檢測，3份HCV血清濃度分別為

1.18 ×107IU/mL、1.32×105IU/mL、1.88×103IU/mL作為本研究的3種初始濃度，將血清及其核酸經(jīng)純化試劑盒純化后各分裝成45份分別儲存在25 ℃、4 ℃、-20 ℃條件下。隨后于1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天分別取出不同溫度儲存的血清與核酸檢測病毒載量的變化情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

3.2 HCV RNA病毒載量檢測：采用凱杰生物工程（深圳）有限公司的HCV核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法）進(jìn)行核酸提取和PCR擴(kuò)增檢測。核酸提取與純化嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，同時設(shè)HCV陰性對照品、臨界陽性對照品、強(qiáng)陽性對照品。向1.5 mL的滅菌離心管中加入25 μL蛋白酶溶液，并加入待測樣本200 μL和新鮮配制的裂解液，充分混勻，于56 ℃水浴15 min。再加入250 μL無水乙醇，徹底混勻。15～25 ℃靜置5 min，轉(zhuǎn)入加套管的核酸純化柱，6 000 g離心1 min。倒掉套管中的廢液，將提取柱重新放入套管中。向核酸純化柱中先后加入500 μL洗液1、洗液2、無水乙醇，分別于6 000 g離心1 min，棄液，放入新的提取柱于套管中，棄套管。將提取柱放入新的收集管中，20 000 g離心3 min，徹底去除乙醇。棄收集管，將核酸純化柱放入干凈的1.5 mL離心管中，打開提取柱的蓋子，56℃水浴3 min。將核酸純化柱放入另一干凈的1.5 mL離心管中，加入60 μL洗脫液，蓋上蓋子，室溫靜置10 min。20 000 g高速離心1 min，收集濾出液，做好標(biāo)記，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉暮怂嵩? h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增按照試劑盒說明書配置反應(yīng)液，每個反應(yīng)體系含有HCV RT-PCR反應(yīng)液28 μL，酶混合物2 μL，待測樣品的核酸提取物20 μL，反應(yīng)總體系50 μL。擴(kuò)增和檢測參數(shù)為50 ℃ 30 min，95℃ 15 min，95 ℃ 15 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 15 s，熒光信號收集設(shè)在50 ℃，45個循環(huán)。擴(kuò)增檢測根據(jù)設(shè)置的HCV定量標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度由儀器軟件自動分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將樣本處理組及各時間點(diǎn)的檢測結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，并計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行多個樣本與多個時間相關(guān)聯(lián)，采用多元球形檢驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血清H C V載量與儲存溫度及初始濃度的關(guān)系 血清H C V載量隨儲存時間的延長呈顯著變化（F=3 7 5.4 4 9，P＜0.0 5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HCV載量隨儲存時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。血清HCV載量隨時間的變化與儲存溫度、初始濃度均相關(guān)（F=1.941，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。107IU/mL、105IU/mL、103IU/mL血清分別儲存在不同條件下1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天后分別取出，在室溫條件下提取核酸和檢測其病毒核酸載量，進(jìn)行不同濃度的血清樣本在相同儲存時間不同溫度下比較發(fā)現(xiàn)，107IU/mL、105IU/mL、1 03IU/mL三者間兩兩比較均存在顯著性差異（P＜0.05），HCV濃度越高其穩(wěn)定性越好。4 ℃與-20℃儲存的血清HCV載量無顯著性差異（邊緣P值，P＝0.68＞0.05），兩者均與25 ℃儲存的血清HCV載量存在顯著性差異（P＜0.05）。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)表明4 ℃與-20 ℃儲存比25℃更好的保持HCV RNA的穩(wěn)定性。 如圖1顯示，在25℃儲存條件下，103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV血清樣本分別存放9天、12天、35天后其載量趨于零，表明25 ℃儲存血清易造成HCV核酸的降解。

圖1 三種初始濃度HCV血清病毒載量在不同溫度下隨時間的變化

2 HCV純化核酸與儲存溫度關(guān)系 103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV純化核酸在25 ℃、4 ℃與-20℃存放70天，其結(jié)果如圖2所示，其濃度變化與初始濃度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。由圖2可見，隨著時間的延長，濃度越低的純化核酸會逐漸降解趨于零，103IU/mL的HCV純化核酸在25 ℃存放49天后降解趨于零，在4 ℃與-20 ℃存放56天后呈現(xiàn)顯著降解。而高濃度的107IU/mL HCV純化核酸隨時間的延長降解變化不明顯。

圖2 三種濃度HCV純化核酸在不同溫度存儲下隨時間的變化

討 論

核酸擴(kuò)增技術(shù)由于靈敏性強(qiáng)、特異性高，能迅速再現(xiàn)血清或血漿病毒載量，已被廣泛應(yīng)用于病原體載量的臨床檢測。由于HCV是一種RNA病毒，離體后易受外界環(huán)境的影響引起RNA降解，因此，標(biāo)本采集后的保存條件對HCV檢出率有直接影響。

血清樣本病毒濃度與儲存溫度直接影響HCV的穩(wěn)定性。BALERIOLA[5]、DAMEN[6]等研究證實(shí)，HCV RNA儲存在-70 ℃12個月甚至15個月仍然穩(wěn)定。劉長利等[7]報道，血樣在4℃保存7～14天，其HCV RNA的檢出量變化不明顯。SENER[8]等研究表明，不同水平HCV RNA的血樣在4 ℃保存35天后，HCV RNA的檢出量變化不明顯，其穩(wěn)定性與標(biāo)本中HCV RNA含量呈正相關(guān)。我們通過研究臨床常見的107IU/mL、105IU/mL、103IU/mL HCV血清載量在不同儲存條件下隨時間變化的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV血清樣本分別在25℃存放9天、12天、35天后，其載量呈明顯的下降趨勢，且隨時間的延長，下降趨勢愈見明顯。曾有文獻(xiàn)[9]報道，血液中HCV RNA起始濃度較低，其穩(wěn)定性越差，短時間常溫保存便會造成病毒核酸的降解，此結(jié)論與我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。與25 ℃儲存相比，4 ℃和-20 ℃能較好的保持HCV血清樣本的穩(wěn)定。然而，4 ℃和-20 ℃儲存相比較，差異不顯著，為邊緣P值，我們今后將擴(kuò)大樣本量、延長實(shí)驗(yàn)周期進(jìn)一步研究。

HCV純化核酸濃度對其穩(wěn)定性有直接影響，隨著時間的延長，儲存溫度的影響更加顯著。有文獻(xiàn)[10]報道，HCV核酸在室溫（25 ℃）和4 ℃中儲存至少3天以上依然穩(wěn)定。JOSE′等[9]人的研究表明，HCV和HIV RNA儲存在-20℃中超過5年的核酸載量沒有明顯變化。近年有文獻(xiàn)[11]報道純化的HCV RNA及HIV RNA在2～8 ℃條件下至少可以保存7天。本實(shí)驗(yàn)中HCV純化核酸在25 ℃、4 ℃與-20 ℃條件下儲存70天其濃度變化與初始濃度呈負(fù)相關(guān)。

由于RNA結(jié)構(gòu)的特殊性，研究HCV血清及其純化核酸的穩(wěn)定性和影響因素對血液篩查具有深遠(yuǎn)的意義。臨床檢測HCV載量可提示病毒復(fù)制能力，對了解疾病的自然進(jìn)程起著至關(guān)重要的作用。獻(xiàn)血者中潛在的HCV感染者，大部分是“窗口期”低病毒載量且易漏檢的感染者，嚴(yán)重威脅血液制品的安全。優(yōu)化血液標(biāo)本運(yùn)輸條件和儲存方法，對獲得準(zhǔn)確的病毒載量、防止“窗口期”漏檢、保障血液制品安全具有重要意義。通過上述的研究結(jié)果表明，4 ℃與-20 ℃保存HCV血清，能更好地保持樣本的完整性。我們在實(shí)際工作中，應(yīng)保證樣本在4 ℃或-20 ℃運(yùn)送與保存，如未能及時檢測，需盡早提取并純化核酸，保證其檢測結(jié)果符合病毒的真實(shí)載量，有效鑒別“窗口期”的潛在感染者。

致謝我們由衷地感謝解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨檢中心及全軍傳染病研究所臨床研究管理中心的技術(shù)支持與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)！

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突