核酸檢測反應性獻血者歸隊方案探討*

任亞娜 周國平

我國從2010年起在血站系統(tǒng)逐漸開始血液篩查NAT（nucleic acid testing，NAT）試點工作，目前已基本實現(xiàn)了全面覆蓋，它在血液篩查方面的優(yōu)勢也越來越明顯。但是與酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）一樣，用高靈敏度的核酸篩查試劑檢測健康的獻血者，必定存在假反應性結果。假反應性的原因包括試劑、獻血者自身和技術等導致檢測信號非正常上升的因素，乙肝、丙肝等核酸篩查試劑的假反應性結果，國內(nèi)外均有文章報道[1-3]?；谟行ПＷo獻血者的權利，珍惜有限的血液資源，歐盟、英國、美國均已相繼制定了核酸反應性獻血者屏蔽與歸隊指南[4-8]。我國已制定團體標準血液篩查反應性獻血者歸隊指南[9]，但核酸反應性獻血者的相關方案還沒有納入歸隊指南中，需要進一步探討和研究。本研究通過對NAT反應性獻血者再召回進行檢測，并增補化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），初步確定歸隊結果判斷規(guī)則，設計了核酸反應性獻血者歸隊方案供開展歸隊工作的血站探討參考。

資料與方法

1 材料

1.1 研究對象：篩選上海市血液中心2012年～2017年ELISA無反應性、HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA反應性獻血者，間隔至少6個月后進行召回，每輪召回收集血液樣本15 mL，分別采集在2支酶免管和1支核酸管中。

1.2 試劑：乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗原抗體、梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（上?？迫A生物工程股份有限公司，Diasorin S.p.A. UK Branch，Ortho-Clinical Diagnostics, Inc，廈門新創(chuàng)科技有限公司，珠海麗珠試劑股份有限公司）以及相關血清（液體）標準物質(zhì)（北京康徹思坦生物技術有限公司）。NAT試劑：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑（PCR-熒光法）（Roche Molecular Systems, Inc）以及相關質(zhì)控品（北京康徹思坦生物技術有限公司）。HBsAg、HBeAg、Anti-HBs、Anti-HBc、Anti-HBe、Anti-HCV、Anti-HIV化學發(fā)光免疫分析法試劑以及相關質(zhì)控品（Roche Molecular Systems, Inc）。

1.3 設備：Microlab STAR全自動加樣系統(tǒng)（HAMILTON BonaduzAG）；Freedom Evo Clinical免疫分析加樣系統(tǒng)（Tecan Schweiz AG）；MicrolabF.A.M.E. 全自動酶免分析儀（HAMILTON Bonaduz AG）；COBAS AmpliPrep全自動核酸分離純化系統(tǒng) （羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）；COBAS TaqMan系統(tǒng)（羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）；COBAS e411全自動電化學發(fā)光免疫分析儀（羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）。

2 方法

2.1 ELISA和NAT（PCR-熒光法）：嚴格按照ELISA試劑盒說明書要求對血液標本進行乙肝病毒抗原、丙肝病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗原抗體和梅毒螺旋體抗體檢測。四個項目都利用兩種廠家的試劑，進行兩遍檢測以及反應性雙孔復檢。嚴格按照乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑盒說明書對標本進行乙肝病毒DNA、丙肝病毒RNA、人類免疫缺陷病毒RNA單檢。室內(nèi)質(zhì)控結果符合檢驗科室內(nèi)質(zhì)控要求，并按照血站技術操作規(guī)程判斷ELISA和NAT結果。

2.2 CLIA（電化學發(fā)光法）：嚴格按照試劑盒說明書進行全自動電化學發(fā)光免疫分析儀儀器校正及羅氏配套定標液進行試劑的定標，乙肝兩對半（HBsAg、HBeAg、Anti-HBs、Anti-HBc、Anti-HBe）、丙肝病毒抗體（Anti-HCV）、人類免疫缺陷病毒抗體（Anti-HIV）共7個項目定標完成后進行相應項目的檢測。質(zhì)控品分析程序，采用相應項目配套質(zhì)控品監(jiān)測實驗的可控。

結 果

1 第一輪召回ELISA和NAT結果 第一輪共召回42人，其中HBV-DNA反應性獻血者37人， HCV-RNA反應性獻血者4人，HBV-DNA反應性且HCV-RNA反應性獻血者1人。第一輪召回的獻血者樣本先通過血清學檢測方法（兩遍ELISA）和核酸檢測方法（NAT單檢）進行歸隊檢測標志物（HBV、HCV、HIV和TP）的檢測。41位獻血者中檢測結果為ELISA無反應性/NAT反應性的15人（占64.3%），ELISA無反應性/NAT無反應性的26人（占35.7%）。其中HBV-DNA反應性且HCV-RNA反應性的該位獻血者第一輪召回檢測結果為ELISA 無反應性/NAT 無反應性（表1）。

表1 核酸反應性獻血者第一輪召回檢測結果

2 第一輪召回CLIA結果 第一輪召回檢測為ELISA無反應性/NAT無反應性的獻血者（27人），再采用CLIA檢測乙肝五項、Anti-HCV和Anti-HIV，結果如下。9人（占33.3%）化學發(fā)光結果為Anti-HBc反應性/Anti-HBe反應性、14人（占51.9%）化學發(fā)光結果為Anti-HBc反應性、4人（占14.8%）CLIA結果為7項檢測全部為無反應性（表2、表3）。其中HBVDNA反應性且HCV-RNA反應性的該位獻血者化學發(fā)光結果為Anti-HBc反應性。

表2 ELISA無反應性/NAT無反應性獻血者化學發(fā)光法檢測結果

表3 HBV-DNA、HCV-RNA反應性獻血者化學發(fā)光檢測結果

3 第二輪召回檢測結果 至少間隔6個月進行第二輪召回，召回的18人第一輪檢測為ELISA無反應性/NAT無反應性/CLIA無反應性的1人、 ELISA無反應性/NAT無反應性/CLIA反應性的10人、 ELISA無反應性/NAT反應性/CLIA 反應性的7人。召回后進行兩遍ELISA和NAT單檢，而且進行了CLIA試驗，結果見表4。其中有1人第一輪檢測結果ELISA無反應性 /NAT無反應性/CLIA反應性，而第二輪檢測結果HBV-NAT轉(zhuǎn)為反應性；1人第一輪檢測結果ELISA無反應性/NAT反應性/CLIA反應性，而第二輪檢測結果為NAT無反應性。其余的第一輪和第二輪檢測結果一致。

表4 第二輪召回檢測結果

4 歸隊方案的初步設計 根據(jù)實驗結果，初步設計了HBV NAT和HCV NAT反應性獻血者歸隊方案：第一輪召回檢測為ELISA反應性/NAT反應性和ELISA反應性/NAT無反應性的獻血者，兩種ELISA試劑均為反應性的建議永久屏蔽；ELISA無反應性/NAT反應性獻血者暫時屏蔽，屏蔽一段時間（如6個月）可進入第二輪歸隊流程；ELISA無反應性/NAT無反應性獻血者若CLIA中任一項反應性（除Anti-HBs）則建議永久屏蔽；ELISA無反應性/NAT無反應性獻血者CLIA所有項目均無反應性獻血者建議可以歸隊（圖1）。第二輪召回檢測ELISA、NAT和CLIA若有任一項反應性（除Anti-HBs）建議永久屏蔽；召回檢測結果均為無反應性的獻血者，建議可以歸隊（圖2）。

圖1 HBV、HCV NAT反應性獻血者第一輪歸隊流程圖

圖2 HBV、HCV NAT反應性獻血者第二輪歸隊流程圖

討 論

核酸反應性的血液報廢，核酸反應性獻血者永久屏蔽，在保護受血者的安全起到積極的作用，但隨著核酸檢測在血篩領域的廣泛應用，也有許多獻血者因核酸假反應性結果被永久屏蔽。因此，核酸反應性獻血者歸隊問題也漸漸引起了國內(nèi)外血站的關注。在廣泛參考歐盟、美國、英國等發(fā)達國家的相關標準，并且充分考慮我國的國情，制定核酸反應性獻血者屏蔽或召回流程，為開展相關工作提供一個技術途徑。我國關于NAT反應性獻血者歸隊問題及方案目前研究的還很少，大多只有對獻血時采集的樣本進行進一步的實驗研究[10-11]。有血站已在進行獻血者歸隊工作，但未進行相應的如化學發(fā)光等補充試驗[12-13]。

本研究初步設計HBV、HCV NAT反應性獻血者歸隊方案：召回符合條件的獻血者，采集標本后采用原來的以及更為靈敏的檢測方法（CLIA）檢測。本研究采取原來的ELISA檢測試劑和方法以及核酸檢測單檢模式。實驗結果顯示，64.3%的獻血者第一輪召回檢測結果為ELISA無反應性/NAT無反應性，可能存在上次獻血篩查假反應性，然后通過CLIA作為補充實驗。第一輪召回檢測結果為ELISA無反應性/NAT無反應性進行化學發(fā)光實驗，85.2%為Anti-HBc反應性和/或Anti-HBe反應性，且結果顯示第一輪Anti-HBc和/或Anti-HBe反應性者第二輪仍為反應性。有文章報道，將乙肝ELISA無反應性/NAT反應性獻血者標本，進一步分析發(fā)現(xiàn)大多為HBV隱匿性感染[14-15]。隱匿性乙肝感染發(fā)生機制與乙型肝炎病毒變異密切相關，是輸血傳播乙肝病毒的潛在危險；Anti-HBe反應性標本，可能為近期感染或急性恢復期或感染已恢復。因此，建議ELISA無反應性/NAT無反應性/CLIA反應性獻血者在第一輪永久屏蔽。

本研究中有1例ELISA無反應性/HBV-NAT反應性獻血者第一輪召回檢測結果為ELISA無反應性/HCV-NAT反應性且ALT不合格，首先懷疑是否存在HCV感染窗口期。6個月后又召回進行檢測，ELISA無反應性/NAT無反應性、ALT正常，考慮可能為獻血者自身原因?qū)е碌臋z測信號的假性升高。另外，結果顯示4例ELISA無反應性/HCV-RNA反應性的獻血者化學發(fā)光檢測結果有1例Anti-HBc/Anti-HBe反應性、1例Anti-HBc反應性，考慮是否有重疊感染或因獻血者自身原因?qū)е碌臋z測信號的假性升高。為了血液安全考慮，建議核酸反應性獻血者若化學發(fā)光乙肝五項或丙肝抗體有任一項反應性（除Anti-HBs）則屏蔽?；瘜W發(fā)光實驗中14.8%為所有項目均無反應性，可準許其解除屏蔽，再次參加獻血的程序。

35.7 %獻血者第一輪召回檢測仍為ELISA無反應性/NAT反應性，建議6個月后進入第二輪歸隊檢測。第二輪歸隊檢測為ELISA無反應性/NAT無反應性且CLIA無反應性的獻血者，建議也可回歸獻血者隊伍；若ELISA、NAT或CLIA任一項有反應性，建議永久屏蔽。按照本研究初步設計的NAT反應性獻血者歸隊流程，本次的研究對象42人中4人（占9.5%）的NAT反應性獻血者召回后，檢測結果符合歸隊條件，可解除屏蔽回歸獻血者隊伍。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突