免疫沉淀法與質譜聯(lián)用檢測RHD蛋白序列方法學的建立*

鐘福鈴 梁延連 蘇宇清 吳凡 梁爽 張海璇 洪文旭 徐筠娉

Rh血型在臨床輸血中的重要性僅次于ABO血型，Rh抗原是由染色體1p 3 4-p 3 6上兩個同源基因RHD和RHCE（序列同源性為96%）編碼的膜蛋白，其屬于非糖基化疏水跨膜蛋白的一個家族，這兩個基因很可能是由一個共同的祖代基因復制而來。Rh血型抗原至少由三種非同源的膜蛋白（RHD、RHC/c、RHE/e）攜帶，它們的分子量在30 000至32 000之間，但其不是糖基化蛋白[1-2]，而是紅細胞膜上一種脂肪酰化的化學成分[3-4]。RhD抗原是具有復雜多態(tài)性的抗原，其變異體在輸血醫(yī)學中具有極其重要的意義，如弱D表型曾被稱為Du型，和正常RhD陽性紅細胞上的D抗原相比，弱D表型紅細胞D抗原質量未改變，只是數(shù)量減少，抗-D血清有時無法鑒定出D抗原導致誤判血型[5]。本研究通過應用免疫沉淀法[6]與質譜技術[7]檢測RHD蛋白的氨基酸序列可以獲取最大量的人類紅細胞膜RHD蛋白序列信息，對存在RHD基因但血清學未檢測到RhD抗原的紅細胞進行精確定型，同時為進一步探討RHD基因調控RhD抗原在紅細胞上的表達奠定基礎。

資料與方法

1 試劑 R I P A蛋白裂解液（RIPA Lysis and Extraction Buffer，Thermo Fisher Science）、B C A蛋白定量試劑盒（Pierce? BCAProtein Assay Kit，Thermo Fisher Science）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT，PlusOne）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA，Sigma）、胰蛋白酶（Trypsin，Promega，V5280）、胰酶重溶液（Trypsin resolve solution，Promega，V530）、碳酸氫銨（Ammonium bicarbonate，Sigma A6141）、甲酸（FA，Sigma）、乙腈Acetonitrile（Fisher）、甲醇methanol（Fisher）、Rh抗-D血清。

2 儀器 Obitrap Q Exactive mass spectrometer（Thermo Fisher Scientific，USA）、多功能酶標儀（MDParadigm），Concentratorplus真空離心濃縮儀（Eppendorf），SartoriusBP 2 1 1d分析天平（Sartorius），高速離心機（Thermo Fisher Scientific）。

3 研究對象 隨機選取10例已知RhD陽性的無償獻血者的抗凝血5 mL（本研究經深圳市血液中心倫理委員會批準，文中所涉及獻血者均已被告知實驗內容并由本人簽署知情同意書），其中血型定型分別為：RhCCDee（3例）、RhCcDEe（5例）、RhccDEE（2例）。

4 檢測方法

4.1 蛋白質提?。孩偃〖t細胞樣品100 μL加入1 mL預冷的Lysis Buffer，使用超聲破碎儀破碎細胞，超聲2 s暫停2 s，共超聲10 min。②4℃ 14 000 g離心15 min，立即將上清液轉移到新的離心管中。

4.2 BCA法蛋白質定量：①配制濃度為0.0 2 5、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500、2.000（μg/μL）的標準品溶液，并將樣品稀釋50倍備用。②分別取25 μL標準品及樣品于微孔板中，每孔中加入200 μL工作試劑。在微孔板振蕩器上混合30 s后，37℃孵育30 min。③冷卻至室溫后，在多功能酶標儀上測量562 nm處的吸光度。制備標準曲線，并計算樣品濃度。

4.3 免疫沉淀：①準備Protein A agarose，用PBS洗兩遍瓊脂糖珠，然后用P B S配制成5 0%濃度。②每1 mg總蛋白中加入100 μL Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插于冰上，放置水平搖床），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。③4℃ 14 000 g離心15 min，將上清液轉移到新的離心管中，去除Protein A瓊脂糖珠。④用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μL，以降低裂解液中去垢劑的濃度。⑤加入200 μL Rh抗-D抗體到500～1 000 μg總蛋白中，4℃緩慢搖動抗體和細胞裂解液混合物過夜。⑥加入100 μL的Protein A瓊脂糖珠捕捉抗體及其結合的蛋白，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜。⑦在14 000 g瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗體復合物，去上清，用800 μL預冷的PBS buffer洗滌3遍。

4.4 蛋白酶切：①用50 mmol/L NH4HCO3溶液清洗protein A beads兩次，將beads分散于100 μL 50 mmol/L的NH4HCO3溶液。②加入DTT溶液使其終濃度為10 mmol/L，于56℃水浴中還原1 h。加入IAA溶液使其終濃度為50 mmol/L，避光反應40 min后，加入DTT溶液使其終濃度為20 mmol/L中和過量的IAA。③按照胰蛋白酶與底物質量比為1∶100加入胰蛋白酶，37℃酶切4 h，繼續(xù)按質量比1∶100加入胰酶，37℃酶切反應過夜（16 h）。④使用自填脫鹽柱脫鹽后，于45℃真空干燥備用。

4.5 質譜鑒定分析：①肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，充分振蕩渦旋，13 200 r/min，4℃離心10 min，上清液轉移到上樣管中進行質譜鑒定。②色譜信息，預柱300 μm i.d.×5 mm， packed with Acclaim PepMap RPLC C18，5 μm，100 ?；分析柱75 μm i.d.×150 mm，packed with Acclaim PepMap RPLC C18，3 μm，100 ?；流動相A，0.1%甲酸，2%CAN；流動相B，0.1%甲酸，80%CAN；流速300 nL/min；每個組分析時間60 min。③分離后的肽段直接進入質譜儀Thermo Scientific Q Exactive進行在線檢測，一級質譜參數(shù)，Resolution 70 000，AGCtarget 3e6，MaximumIT 40 ms，Scanrange 350 to 1 800 m/z；二級質譜參數(shù)，Resolution 17 500，AGCtarget 1e5，MaximumIT 60 ms，TopN 20，NCE/steppedNCE 27。

4.6 數(shù)據庫檢索：質譜原始文件，Max Quant[8]（1.5.6.5）檢索目標蛋白及uniprot-Human數(shù)據庫，檢索參數(shù)①固定修飾（Fixed modifications），Carbamidomethyl （C）。②可變修飾（Variable mod if ications），Oxidation （M）。③酶（Enzyme），Trypsin。④遺漏酶切位點（Maximum Missed Cleavages），2。⑤一級質譜誤差（Peptide Mass Tolerance），2 0 p p m。⑥二級質譜誤差（Fragment Mass Tolerance），0.5 Da。⑦肽段/碎片離子質量數(shù)（Mass values），Monoisotopic（單同位素）。⑧顯著性閾值（Significance threshold），0.05。

結 果

1 蛋白濃度檢測 根據配制已知濃度的標準品溶液得到蛋白濃度的標準曲線，見圖1。

使用免疫沉淀法提取紅細胞上的RHD蛋白，通過標準曲線可以計算出10例標本的RHD蛋白濃度，見表1。

2 蛋白鑒定結果

2.1 目標蛋白搜庫結果：將鑒定到RHD蛋白的目標肽段與參比序列GenBank AEY68242.1進行比對，發(fā)現(xiàn)所檢測到的10例樣本的RHD蛋白序列與原參比序列的吻合度均達到100%，見表2。

表2 1～10號樣本鑒定到的RHD蛋白氨基酸長度、肽段數(shù)與原參比序列的吻合度

2.2 鑒定肽段二級圖譜：10例樣本均獲得了不同肽段碎片離子，每例樣本檢測到的肽段離子組合得到該樣本的紅細胞膜RHD蛋白肽段二級圖譜，選取1例樣本的肽段二級圖譜作為代表圖，如圖2所示。

圖2 紅細胞膜RHD蛋白肽段二級圖譜代表圖

紅細胞膜在低溫與超聲破碎儀的作用下裂解，通過特定抗-D抗體的免疫沉淀作用提取到高濃度的RHD蛋白。利用蛋白質質譜（MS）技術可以將檢測到的肽片段序列在數(shù)據庫中進行鑒定。此外，質譜技術還可以處理任意多碎片的肽段數(shù)據，能夠對翻譯后修改的復雜模式（如高度磷酸化的肽）進行賦值和評分。MaxQuant計算蛋白質組學平臺具有識別多肽段的能力，在檢測RHD蛋白方面具有顯著的優(yōu)勢。

討 論

RHD蛋白包括RHD和RHCE蛋白，兩者的多肽鏈結構相似并具有高度的同源性[9]。此外，還有另一種蛋白Rh50，稱為Rh相關蛋白（RHAG），RHAG與RHD、RHCE的氨基酸序列存在32.9%、38.5%的相似性，三者之間有12個相似的跨膜結構域[10]。RHAG蛋白不具有血型系統(tǒng)的多態(tài)性，即不產生血型抗原，但它可以輔助RHD及RHCE蛋白固定在紅胞膜上，形成RHD蛋白復合體。RHAG蛋白還參與RHD抗原的缺失和表達[11]。通過對紅細胞上RHD蛋白的分析研究，我們可以精確鑒定RhD血型，同時可以更深入地了解RHD蛋白的功能與RhD抗原在紅細胞上的表達以及相關RH蛋白家族之間的聯(lián)系。

本研究應用免疫沉淀法通過特異性抗-D抗體與紅細胞上的RhD抗原結合并形成沉淀物，通過Protein A的作用來純化及捕捉抗體及其目標蛋白。使用Promga公司生產的胰蛋白酶進行一步法酶切得到特異性RHD蛋白肽段，再通過質譜儀Thermo Scientific Q Exactive進行在線檢測得到相關質譜參數(shù)。所有的參數(shù)通過Maxquant軟件進行Protein ID分析得到目標蛋白的顯著性閾值，制備出實驗樣品RHD蛋白定量的標準曲線，通過標準曲線可以計算出每一例樣本的RHD蛋白濃度。Uniprot-Human數(shù)據庫中檢索到RHD蛋白的氨基酸序列，在NCBI的BLAST Genomes上與人類RHD蛋白參比序列比對發(fā)現(xiàn)檢測到的蛋白肽段與RHD蛋白的氨基酸序列完全吻合。結果表明，特異性的免疫沉淀法與質譜聯(lián)用是一種獲得高純度RHD蛋白的可靠方法，用針對RHD蛋白的抗-D抗體在胰蛋白酶的作用下可以純化目標蛋白組分，從肽段的二級圖譜中可以看到質譜相對于基峰的離子峰度較明確，氨基酸序列的長度與峰值成正比，可有效檢測RHD蛋白的序列。Rh血型抗原系統(tǒng)是非常復雜的血型系統(tǒng)，有人認為，不同的Rh血型抗原的產生是Rh mRNA選擇性剪接的結果[12]，選擇性的剪接造成了個體間Rh抗原表達的差異。Rh血型因種族不同而有差異，亞洲地區(qū)的Rh陰性族群中有30%是帶有完整RHD基因的DEL血型，但其D抗原表現(xiàn)微弱甚至無法用傳統(tǒng)血清學方法測出，須通過吸收與放散試驗或敏感性更強的流式細胞技術才能檢測到[13-14]，也有通過基因測序的方法來鑒定RhD血型[15]。但這些方法均存在實驗操作的主觀性影響，或方法學本身的局限性會影響實驗結果的可靠性，例如吸收放散方法會受吸收時間、溫度、洗滌紅細胞次數(shù)甚至鹽水的洗滌量、放散試劑等影響?；驕y序的分析結果只能說明RHD基因的存在，不一定能說明紅細胞表面RhD抗原的表達量。因此，本研究建立的方法能直接鑒定紅細胞膜上RHD蛋白是否存在，說明了Rh抗原在紅細胞上的表達與RHD基因具有直接的相關性。

免疫沉淀法與質譜聯(lián)用技術可以準確檢測人類RHD蛋白的氨基酸序列，為RhD血型的精確定型以及RHD基因與抗原表達的研究打下基礎，進一步為RHD蛋白對應的抗原多態(tài)性、功能以及結構的深入研究提供幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突