石磊,王曼,時國強,董振國,劉昱
(1 .暨南大學 食品安全與營養(yǎng)研究院,廣東 廣州 510000;2.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,河北 保定 071003; 3. 河北三獅生物科技有限公司 研發(fā)部,河北 石家莊 050000)
病原微生物常常存在于食品源以及食物產(chǎn)品之中,往往造成疾病傳染以及難以估量的經(jīng)濟損失. 最初,聚合酶鏈式反應(PCR)技術常常被應用于食品以及肉源動物的病原微生物檢測,然而其具有操作煩瑣、檢測設備昂貴、檢測時間較長、假陽性多等缺點,使得研究人員不斷探尋代替該技術的方法.環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術具有高靈敏度、運行簡潔、實驗設施低廉、高特異性等優(yōu)勢,被轉(zhuǎn)基因檢驗[1]、胚胎性別鑒別[2-3]、病原微生物[4-8]等方面廣泛采納、應用.迄今為止, 關于LAMP 在食品安全檢測、植物水產(chǎn)檢疫以及人類醫(yī)學檢測等方面的應用也越來越廣泛[9]. 近年來,研究人員對LMAP進行不斷改良并與其他技術聯(lián)用,其巨大的技術優(yōu)勢在檢驗病原微生物的應用中越來越明顯.因此回顧LAMP的發(fā)展經(jīng)過以及展望其發(fā)展方向,是十分必要的.
21世紀初,Notomi 等[9]宣布發(fā)明了環(huán)介導等溫擴增(LAMP),不同于PCR僅僅需要設計上下游引物,LAMP則需要設計包括外引物、內(nèi)引物最少4條引物. 利用具有鏈置換效應以及識別延伸效應的BstDNA聚合酶,對目的片段進行大量且快速的擴增. LAMP的原理在于根據(jù)目的基因的保守序列設計出1組引物,即內(nèi)外引物(FIP、BIP,F(xiàn)3、B3),利用Bst DNA聚合酶的相關功能對目的基因片段進行特定的指數(shù)式體外擴增,以此就可以檢測出目的基因. Nagamine等[10],通過設計1對環(huán)引物來大幅推進反應速率,耗時減少了0.5 h,使得LAMP檢測更加迅速,然而添加環(huán)引物會增加引物錯配概率.反應主要包括2個階段:1)在適宜的溫度下,由外引物以及內(nèi)引物擴增出“啞鈴狀”的擴增元件; Bst 酶作用于擴增元件,由于折疊效應,使得FIP折疊環(huán)化,Bst酶開始鏈置換并進行合成,替換出的單鏈核酸繼續(xù)環(huán)化.2)從內(nèi)引物BIP的3′末端B1區(qū)間開始擴增,以內(nèi)引物為模板,促使單鏈核酸合成延伸及鏈置換,生成2條環(huán)化DNA片段. 內(nèi)引物上的B2區(qū)域與其雜交,開始新的循環(huán)擴增. 另外,可以設計1對環(huán)引物(LF/LB)以提高擴增效率.擴增終產(chǎn)物具有不同個數(shù)莖環(huán)結構,并且片段大小也不一致,在凝膠電泳擴增后顯現(xiàn)出1組特殊的擴增條帶.
LAMP在食品安全中檢測真菌、細菌等病原微生物污染的應用已經(jīng)得到了廣泛的關注與認可[11].何琳[12]通過優(yōu)化LAMP反應體系中的鎂離子濃度、甜菜堿濃度、反應溫度等條件后,發(fā)現(xiàn)對蝦的白斑病病毒(white spotsyndrome virus)檢測只需45 min就有了顯著的檢出效果,在加入SYBR GeenⅠ后可達到肉眼可見的檢測效果.張蕾等[13]將LAMP檢測法從檢出限、特異性等方面與QRT-PCR、普通檢測方法進行對比,并將優(yōu)化調(diào)試后的LAMP法應用于食品安全相關方面的沙門氏菌檢測中. 實驗發(fā)現(xiàn)該方法與實時熒光PCR具有幾乎一致的特異性, 并且檢測更加靈敏. Ferrara等[14]建立了一種基于fum10基因設計引物的方法,并與作為標準的比色法對比.對產(chǎn)伏馬菌素B2的黑曲霉(Aspergillusniger)和衛(wèi)氏曲霉(A.welwistchiae)進行了快速、特異的檢測,可用于玉米食品鏈現(xiàn)場監(jiān)測,適用于田間粗提取的DNA樣本的可視性評估.呂觀等[15]開發(fā)了免疫磁珠分離(IMS)聯(lián)合LAMP技術,用來檢測牛肉中含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium.)這2種常見的食品污染菌. 首先將2種菌的抗體蛋白進行生物素標記,通過對鏈霉親和素磁珠進行功能性修飾,進而濃縮和檢驗牛肉中的目標病菌.
近年來,隨著等溫核酸擴增技術改良研究的不斷開展,LAMP被越來越多的領域認可,逐漸拓展到了家禽畜牧業(yè)疫病防治和人類醫(yī)學的檢測領域,對比PCR檢測具有明顯優(yōu)勢. Chen等[16]采用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)技術,通過將病原病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再通過LAMP擴增檢測病原cDNA,實現(xiàn)了豬瘟病毒(CSFV)的快速檢測.研究發(fā)現(xiàn)該方法的檢出限比標準RT-PCR方法低100倍. 谷曉紅等[17]根據(jù)大腸桿菌的malB基因設計LAMP引物,對飲用水中大腸桿菌進行LAMP檢測,發(fā)現(xiàn)該方法可以快速、靈敏、特異性地檢測到大腸桿菌(Escherichiacoli),對防治大腸桿菌引起的相關傳染病有積極的意義. Htun等[18]采用LAMP法對腐霉病的臨床樣本進行了檢測,發(fā)現(xiàn)其檢測時間比普通PCR檢測縮短了一半,比普通PCR檢測靈敏10倍,特異性也幾乎一致. 更加確定了LAMP檢測在對比檢測的“金標準”PCR檢測時也具有很明顯的優(yōu)勢. Niczyporuk等[19]采用LAMP檢測技術,根據(jù)腺病毒外殼蛋白六鄰體的基因設計引物,首次為波蘭野禽中禽腺病毒(FAV)擴增提供了準確的定量數(shù)據(jù),揭示了腺病毒的種間傳播,并證明了禽腺病毒在野禽中的傳播.Yu等[20]根據(jù)ORF2基因設計LAMP引物,建立了一種快速簡便檢測臨床樣品中鵝星狀病毒(GAstVs)的RT-LAMP方法,并與傳統(tǒng)RT-PCR和巢式RT-PCR方法進行了比較. 結果表明,該方法與后者具有相同的靈敏度,相較前者的方法靈敏度高1個數(shù)量級.
陳濤等[21]分別采用LAMP法、直接涂片法、羅氏固體培養(yǎng)法及QPCR法對2 000多份痰標本中結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)進行檢測.在陽性檢出率上,LAMP法比臨床主流檢測方法——涂片法高,與另外2種檢測方法的結果幾乎沒有差別. Takayama等[22]開發(fā)了呼吸道合胞病毒(RSV)與病毒流感病毒(influenza virus)實時RT-LAMP技術,原理是設計1對熒光淬滅引物(QPrimer),當引物與目的片段雜交時,QPrimer胞嘧啶上的熒光基團會與目的片段上的鳥嘌呤殘基發(fā)生光誘導電子穿梭,實現(xiàn)熒光淬滅.對113份臨床標本的檢測結果表明,該方法能夠鑒別呼吸道合胞病毒和流感病毒的類型和亞型,檢測特異性為100%,靈敏度均超過85.0%,15 min左右就可以明顯觀測到陽性擴增曲線.
基于QPrimer法,Le等[23]開發(fā)并驗證了直接rRT-LAMP檢測流感病毒的方法,該方法采用將凍干的樣本加入到反應體系當中,不需要使用RNA分離試劑盒進行核酸純化步驟,也不需要在冰上儲存和處理試劑,在10~30 min內(nèi)完成檢測,在對310個臨床標本進行驗證時顯示出高靈敏度和高特異性.
Garcia-Venzor等[24]建立了一種聯(lián)合LAMP技術和 CRISPR-Cas12技術的方法,首先合成包含新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)N基因mRNA和人類RNAseP POP7 mRNA的基因塊,然后體外轉(zhuǎn)錄作為指導RNA,結合利用CRISPR-Cas12技術可以迅速切取樣品中的新冠病毒中的目的基因片段,然后聯(lián)用LAMP技術可以省略提取RNA的步驟,直接檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2).該方法的檢測限為16 copies/μL,特異性高,成本低.
LAMP方法雖然具有設備低廉、操作簡便、檢測快速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)勢,但是仍有一些技術上的難題:1)擴增得到的目的片段長度存在明顯差異,在凝膠電泳檢測后,結果不容易分析;2)沒有特異性較高且價格低廉的熒光染料,當使用SYBR Geen Ⅰ等常規(guī)熒光染料時容易造成非特異性結合dsDNA從而導致假陽性;3)引物比較復雜,如果設計環(huán)引物,6條引物共存于反應體系之中,可能會造成引物自聯(lián)產(chǎn)生假陽性;4)擴增產(chǎn)物的片段較大,不易降解,很容易造成嚴重氣溶膠污染,為后續(xù)實驗造成麻煩;5)擴增目的片段一般選擇在200 bp左右,很少用于100 bp左右的擴增實驗. 為了克服這些缺陷,近年來大量的科研工作者采用了各種實驗方案進行技術改良,以期該技術可以更加成熟,應用于更加廣泛的領域中. 普通的LAMP檢測,往往只是做到了終端檢測,而熒光實時定量檢測,不但可以在反應進行中實時檢測,而且能夠?qū)U增反應進行定量檢測,達到直觀詳細獲得實驗數(shù)據(jù)的目的.
由于常規(guī)的熒光染料常常造成假陽性,給結果分析帶來麻煩, 所以一些學者嘗試使用熒光探針來代替前者承擔發(fā)射熒光信號功能. 然而,由于6條引物或4條引物(不設計環(huán)引物)已經(jīng)占用了大量目的片段的結合區(qū)域,這就給設計探針增加了難度.
Gadkar等[25]將設計好的環(huán)引物LB的3′端的殘基T上連接FAM熒光基團,該殘基處于3′端末尾倒數(shù)2、3位上,且要求殘基T的2側(cè)有1個G苷,這樣環(huán)引物探針LB在游離狀態(tài)下由于G苷供電子的關系,F(xiàn)AM熒光基團處于自淬滅的狀態(tài),當結合目的片段時,G苷終止供給電子,F(xiàn)AM熒光基團被解除電子供給而發(fā)射熒光信號,完成了一個自淬滅到除淬滅的過程. Elbeaino等[26]在LAMP的內(nèi)引物之間目的片段的空白處設計了TaqMan熒光探針,經(jīng)過實驗測試,特異性明顯增強,避免了假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn). 以上2種方法雖然在設計引物上都有一定的難度,但是卻比Shi等[27]采用雙鏈探針法反應體系要簡單的多. Ding等[28]巧妙地將已經(jīng)設計好的環(huán)引物探針設計成一個發(fā)夾探針,當目標探針沒有與環(huán)引物結合到目標片段上時,由于探針的發(fā)夾性質(zhì)原因,熒光基團與淬滅環(huán)引物基團之間距離很近,熒光基團被探針所淬滅而不能直接發(fā)出熒光信號;當要與目的片段進行結合時,探針依然在內(nèi)切酶作用下打開發(fā)夾結構,使得兩端基團之間距離變大,熒光基團被激活后產(chǎn)生發(fā)射信號進而被系統(tǒng)檢測到,而且探針仍然可以直接起到環(huán)引物作用. 該方法不僅提升了檢測的特異性,而且靈敏度也得到了提高. Kim等[29]在LAMP的LF環(huán)引物的5′端鏈接FAM熒光基團,在3′端鏈接淬滅集團BHQ1,稱之為同化探針[30],并且根據(jù)LAMP內(nèi)引物相對鏈的上游序列設計的“蜂群引物”[31]檢測了豬圓環(huán)病毒3型(PCV3),發(fā)現(xiàn)其靈敏度是普通qPCR的10倍,檢出時間為17 min左右,比普通qPCR快了將近一半,并且kappa值為0.98(置信區(qū)間為0.95~1.00),代表其準確度良好.
目前常用的熒光染料有SYBR GreenⅠ、SolisGreen、EvaGreen等,其中SYBR系列熒光染料最常應用于實驗室中,然而其對于雙鏈DNA的非特異性結合,以及引物自聯(lián)等都會造成假陽性結果. 所以選擇特異性較好的熒光染料對于實驗結果的準確性十分重要.
Tangkanchanapas等[32]使用SYTO9熒光染料進行RTPCR并與羥基萘酚藍(HNB)和加入鈣黃素(加入MnCl2)可視化實驗進行對比. 結果發(fā)現(xiàn),SYTO9具有良好的可視性、靈敏度和特異性. Seyrig等[33]和吳亮等[34]研究表明,SYTO8.1和SYTO9對比SYBR,在其飽和濃度下,DNA鏈的合成不會受到干擾,并且熒光信號更強. 檢測肺炎支原體時,加入SYTO9染料后,當樣本中靶基因拷貝數(shù)達到104時,樣本組熒光即與對照組熒光在0.5 h時差異開始變得尤為明顯.
Frisch等[35]通過優(yōu)化LAMP實驗得出在檢測擴展青霉素時,LAMP適宜溫度為68 ℃,這意味著Bst聚合酶的最適宜溫度不一定局限在60~65 ℃.
Zhou等[36]在標準的25 μL LAMP反應混合物中加入低至0.15 U的高保真DNA聚合酶. 這一數(shù)量足以去除39個3′端引物的錯配堿基,從而使LAMP引物在擴增過程中對3′端出現(xiàn)的各種錯配具有良好的耐受性. 該方法顯著提高了擴增效率,特別是對與6條引物不匹配的突變體. 無論引物和模板是否特異性互補,新方法的反應時間都比傳統(tǒng)LAMP方法快5.6~22.6 min,可用于高度變異病毒的分子診斷,特別適合在資源有限的環(huán)境中應用.
Marciniak等[37]采用可環(huán)化探針將滾環(huán)擴增與LAMP結合的方法,其原理是設計一個“鎖式探針”,反應未開始該探針與目的擴增片段結合形成環(huán)狀,只有當LAMP內(nèi)引物與之結合,LAMP才可以進行擴增.此方法成功檢測到31 bp短片段核酸,解決LAMP不能檢測短片段的問題. Chen等[38]將LAMP和橫向流動生物傳感器(lateral flow biosensors, LFB)技術聯(lián)合起來,傳感器分為控制線和檢測線2個結合區(qū)域,LAMP擴增產(chǎn)物兩端分別修飾熒光素和生物素,當擴增產(chǎn)物與控制線和檢測線結合后,納米金粒子會結合擴增產(chǎn)物,從而產(chǎn)生肉眼可見的紅色條帶,從而創(chuàng)建了一種快速可靠的檢測關西瘧原蟲的方法,具有適用于現(xiàn)場監(jiān)測點檢測的優(yōu)點.
Fu等[39]采用LAMP結合電化學的方法研制了一種高靈敏度檢測B族鏈球菌的LAMP電化學傳感器(LAMP E-sensor). 該方法在1 h內(nèi)大量擴增目標基因,并得到了大量二茂鐵修飾的產(chǎn)物(Fc),用于轉(zhuǎn)化成為電化學信號,這些Fc修飾的產(chǎn)物可以通過Fc和β-環(huán)糊精(β-CD)之間的宿主客體相互作用連接β-CD. 此外,亞甲基藍(MB)嵌入在LAMP產(chǎn)物的雙鏈中,使得MB接近化學傳感器電極,產(chǎn)生了強烈的電化學信號. 使用該MB作為報告基因、Fc作為內(nèi)部對照,LAMP E傳感器顯示出1~100 pg/L的寬檢測范圍和0.23 fg/L的較低檢測限,具有良好的重復性和靈敏度.
Sharma等[40]結合LAMP法開發(fā)了一種全自動芯片微流控實驗平臺,通過精確地控制磁珠的移動以確保吸附在其表面的目的核苷酸片段得到純化和擴增.由于白晶體紫(LCV)染料的比色特性,只要在擴增室中觀察到寨卡病毒靶標發(fā)生顏色變化,就可以判定其為寨卡病毒陽性. 其不但具有優(yōu)異特性,而且在樣品加載后的任何步驟都不需要人為干預,降低了因為技術操作不規(guī)范影響檢測結果的概率.
多重LAMP法指的是在一個反應體系中同時檢測2種或者3種目的基因,要求在反應期間不能出現(xiàn)引物自聯(lián)、錯配的狀況,這就要求設計引物時避免這些問題,提升引物設計的標準.
Siddique等[41]利用groEL和fklB基因,建立了快速、經(jīng)濟、物種特異性和高靈敏度的檢測鰻鱺和溶藻弧菌的單、雙LAMP檢測方法,用于海水人為污染的評估. 該研究采取的檢測方式為顏色反應和凝膠電泳相結合的方法,不能實時監(jiān)測污染程度.
Lin等[42]設計了一種雙重RT-LAMP-LFD檢測法來檢測聯(lián)合引起蝦白尾病的羅氏沼蝦諾達病毒(MrNV)與超小型病毒(XSV),該方法分別設計了2套LAMP內(nèi)外引物,并在內(nèi)引物FIP的5′端上標記了異硫氰酸熒光素(FITC),經(jīng)驗證該方法特異性和檢出限都十分優(yōu)異.
Kim等[43]創(chuàng)建了一種三重環(huán)介導等溫擴增檢測方法,并將其應用于具有代表性的食源性致病菌沙門氏菌模型中,以考察各項性能及對污染食品中病原菌的檢測能力.根據(jù)3種病菌為沙門氏菌屬及其亞種Ⅰ和鼠傷寒沙門氏菌的靶基因設計了3套LAMP引物,每個引物只擴增目標基因,而不與非目標基因雜交.該方法的檢出限為2.5 pg/μL鼠傷寒鏈球菌DNA.
LAMP自2000年問世以來,以其優(yōu)異的性能和低難度的操作,引起了廣泛的關注與研究熱情.近年來,關于LAMP的研究從未間斷過,這不僅僅是因為其具有強大的技術包容性可以與其他技術相聯(lián)合的優(yōu)勢,更因為其巨大的市場潛力.至今,我國已研制出近20種LAMP 檢測試劑盒,并申請專利進行銷售[44].前面已經(jīng)提到,盡管LAMP有如此多的優(yōu)勢,其需要改良的方面仍有不少,今后LAMP將會朝著克服這些劣勢的方向發(fā)展,使其能更好地為人類社會服務.