有機(jī)小分子熒光探針的設(shè)計(jì)及其在酶類腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的研究進(jìn)展

段新瑞，孟天姣

(陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710119)

癌癥是機(jī)體在許多致瘤因素作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖機(jī)制失常后發(fā)生無限增殖而引起的疾病，是人類死亡率較高的疾病之一[1-2].臨床研究結(jié)果表明, 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)可作為判斷疾病發(fā)生的生物學(xué)依據(jù)，因此腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是診斷和跟蹤癌癥的首選方法.許多潛在的疾病標(biāo)志物中，生物酶是由生命體內(nèi)的活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化活性的蛋白質(zhì)[3-5].熒光成像技術(shù)在生物成像分析與疾病診斷與治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[6-9]，它依賴于成像探針的發(fā)展.熒光探針用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有多種優(yōu)點(diǎn), 如操作簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、實(shí)時(shí)成像、經(jīng)濟(jì)、快速響應(yīng)等.其中有機(jī)小分子熒光探針具有易于修飾、易于調(diào)節(jié)光譜、生物相容性好且易于被生物體代謝等優(yōu)點(diǎn), 已廣泛應(yīng)用到細(xì)胞成像、分子標(biāo)記和實(shí)時(shí)成像等方面[10-13].本文主要綜述了近些年新型有機(jī)小分子熒光探針在2種腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的研究進(jìn)展.

1 腫瘤標(biāo)志物

惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)死亡率較高的疾病之一.正常機(jī)體細(xì)胞在致癌因素的驅(qū)使下，能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞從而無限增殖.癌變的細(xì)胞能夠在身體不同部位之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而引起機(jī)體器官、組織結(jié)構(gòu)和功能的損壞[14-16].因此，對(duì)惡性腫瘤及早發(fā)現(xiàn)、確診和針對(duì)性治療是治療惡性腫瘤的最有效方法.腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞宿主對(duì)癌細(xì)胞所產(chǎn)生的可反映癌變細(xì)胞本身特征的化學(xué)物質(zhì).腫瘤標(biāo)志物與腫瘤的進(jìn)化發(fā)展階段息息相關(guān)，從而引起了越來越多研究者們的關(guān)注，其主要的形式有核酸分子、抗原、酶、糖蛋白、激素等[17-21].這些分子的活性水平會(huì)因在患者體內(nèi)的異常表達(dá)而顯著提高[22-24].臨床研究結(jié)果表明，腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)可作為判斷疾病發(fā)生的生物學(xué)依據(jù)，因此腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是診斷和跟蹤癌癥的首選方法.

在許多潛在的疾病標(biāo)志物中，生物酶是由生命體內(nèi)的活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用的有機(jī)物.大量研究表明，某些生物酶的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生息息相關(guān).堿性磷酸酶(ALP)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、硝基還原酶(NTR)、乙醛脫氫酶(ALDH)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GT)以及端粒酶(TE)等都是較為常見的酶類腫瘤標(biāo)志物[25-31].隨著研究的不斷深入，相關(guān)生物酶的活性水平開始成為腫瘤早期診斷的重要指標(biāo)之一.其中，ALP是一種廣泛存在于生物組織中的膜結(jié)合酶，在核酸、蛋白質(zhì)和其他底物的磷酸水解中起著重要作用[32-33].研究表明，ALP水平異常表達(dá)與許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，例如，在淋巴瘤、前列腺癌、肝癌和骨腫瘤中可觀察到 ALP 活性水平明顯升高[34-36].ALP被認(rèn)為是各種癌癥的潛在靶點(diǎn)，因此，實(shí)現(xiàn)對(duì) ALP 活性的高靈敏度和選擇性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)相關(guān)疾病的診斷具有重要意義.NTR是最具代表性的缺氧酶之一，其在惡性腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成中起著巨大的作用，因此，NTR被認(rèn)為是各種缺氧腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵標(biāo)志物[37-39].此外，NTR還參與了解毒、促進(jìn)藥物活化以及放射治療等基本過程[27, 40].因此，NTR的檢測(cè)對(duì)于腫瘤治療和藥物發(fā)展起著非常重要的作用.

2 熒光成像概述

隨著對(duì)光在生物組織中傳播規(guī)律的深入研究，光學(xué)技術(shù)在混濁介質(zhì)(生物組織)研究中已顯現(xiàn)出其特有的優(yōu)勢(shì).光學(xué)成像技術(shù)具有非接觸性、無損傷、高靈敏度和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)生物分子、細(xì)胞、組織和生物體，進(jìn)行實(shí)時(shí)、多維的可視化監(jiān)測(cè)，因此，廣泛應(yīng)用于生物分子檢測(cè)成像、藥物分布代謝跟蹤、疾病檢測(cè)和診斷的研究[41-44].近年來，隨著熒光成像技術(shù)的發(fā)展，臨床上也用其區(qū)分正常組織與病變組織以指導(dǎo)外科手術(shù)切除，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力[45-49].

熒光成像的發(fā)展依賴于成像探針的發(fā)展.迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了多種熒光探針，例如熒光蛋白[50-51]、量子點(diǎn)[52-53]和有機(jī)熒光染料[54-56].隨著熒光探針的發(fā)展，熒光探針用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)顯示出了許多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、實(shí)時(shí)成像、經(jīng)濟(jì)、快速響應(yīng)等[57].有機(jī)熒光探針，包括聚多巴胺納米顆粒[58-59]、有機(jī)小分子熒光探針[60]和熒光共軛聚合物及其納米粒子等，因其可設(shè)計(jì)性和合成可控性在熒光成像方面的應(yīng)用發(fā)展迅速[61-62].其中，有機(jī)小分子熒光探針具有易于修飾、易于調(diào)節(jié)光譜、生物相容性好且易于被生物體代謝等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用到細(xì)胞成像，分子標(biāo)記和實(shí)時(shí)成像等方面[63-64].

3 有機(jī)小分子熒光探針在不同腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的研究進(jìn)展

如圖1，有機(jī)小分子熒光探針通常由熒光團(tuán)(fluorophore)、連接臂(spacer)和識(shí)別基團(tuán)(receptor)3部分構(gòu)成.其中，熒光團(tuán)能夠在吸收光能后發(fā)出熒光信號(hào)，識(shí)別基團(tuán)用于目標(biāo)分析物的識(shí)別，在與目標(biāo)分析物發(fā)生特異性結(jié)合后將信息傳遞給熒光基團(tuán)，使探針分子的性質(zhì)發(fā)生改變.常見的有機(jī)小分子熒光探針主要分為可見光區(qū)小分子熒光探針和近紅外光區(qū)小分子熒光探針.

圖1 有機(jī)小分子熒光探針的結(jié)構(gòu)示意Fig.1 Structure schematic of organic small molecule dyes

3.1 可見光區(qū)小分子熒光探針生物酶檢測(cè)

常見的可見光區(qū)小分子熒光探針有熒光素、查爾酮、香豆素和羅丹明等.其中，熒光素是最常見的有機(jī)小分子熒光探針之一，具有高的量子產(chǎn)率和較高的靈敏度，其衍生物已成功應(yīng)用于多種生物分子活性水平的檢測(cè)[65-66].羅丹明類染料具有剛性平面以及很強(qiáng)的熒光[67-68].更重要的是，羅丹明染料對(duì)細(xì)胞沒有任何毒性.香豆素是一種具有抗癌、抗增殖、抗氧化、抗真菌等優(yōu)點(diǎn)的有機(jī)熒光探針，其本身沒有熒光，它的光學(xué)性質(zhì)可以由可改變的π共軛部分而調(diào)整得到[69-70].查耳酮(α，β-不飽和酮)屬于黃酮類化合物中的一種，具有獨(dú)特的柔性分子結(jié)構(gòu),電子給體和電子受體基團(tuán)修飾的查耳酮是由于其π共軛的骨架面而具有強(qiáng)發(fā)射性，其可以在生物體內(nèi)與多種體內(nèi)代謝物進(jìn)行結(jié)合[71-72].因此，查耳酮是一種很有前途的熒光探針發(fā)光支架材料.

Zhu等[73]報(bào)道了一種新的基于查爾酮的熒光探針(Pycl-NO2)并將其應(yīng)用于內(nèi)源性NTR的檢測(cè)(圖2a).查耳酮衍生物具有中央酮基團(tuán)，其作為熒光發(fā)射染料具有接受電子的特性.該探針利用了基于熒光體上的硝基直接還原為氨的反應(yīng)機(jī)理，Pycl-NO2上的硝基是強(qiáng)的熒光淬滅基團(tuán)，因此這類探針其本身幾乎沒有熒光，當(dāng)吸電子基團(tuán)硝基被酶還原為供電子基團(tuán)氨基時(shí)，這種拉-推效應(yīng)的轉(zhuǎn)換將極大地改變熒光體分子內(nèi)的電子云分布或電子環(huán)境，從而導(dǎo)致光學(xué)信號(hào)的顯著改變，該探針表現(xiàn)出對(duì)NTR的敏感性和選擇性的開啟熒光反應(yīng)，其檢測(cè)限為27 ng/mL.此外，該探針已成功應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞中的缺氧成像，為腫瘤預(yù)診斷提供了有用的工具.3,5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮(DFHBI)是綠色熒光蛋白(GFP)類熒光團(tuán)的小分子，已被廣泛用于感測(cè)生命系統(tǒng)中的各種生物分子. Duan課題組[74]設(shè)計(jì)并開發(fā)了基于GFP的RNA模擬的雙激活的熒光探針(DFHBI-NF)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性NTR(圖2b).基于多米諾分解反應(yīng)，當(dāng)NTR與探針上的硝基發(fā)生還原作用時(shí)，會(huì)發(fā)生電子重排以及碳氧鍵的斷裂反應(yīng)，從而釋放出熒光團(tuán)并導(dǎo)致光學(xué)信號(hào)的改變.此外，由于使用RNA來標(biāo)記細(xì)胞，該探針僅在標(biāo)記后的細(xì)胞中且存在NTR時(shí)發(fā)出熒光.因此，該檢測(cè)系統(tǒng)為基于RNA/DFHBI絡(luò)合物開發(fā)各種遺傳編碼的熒光生物傳感器提供新的可能性.Lee等[75]開發(fā)了一種自校準(zhǔn)的雙組分熒光探針，由NTR敏感的硝基萘酰亞胺和非敏感的香豆素組成(圖2c).同樣是利用了基于熒光體上的硝基直接還原為氨的反應(yīng)機(jī)理.通過監(jiān)測(cè)非癌細(xì)胞和某些癌細(xì)胞的熒光比值，可以比較NTR的相對(duì)活性，并證實(shí)NTR活性升高與癌細(xì)胞和缺氧狀態(tài)有關(guān).

圖2 Pycl-NO2(a)和DFHBI-NF(b)香豆素基-NTR(c)NTR-AHC(d)體內(nèi)內(nèi)源性NTR檢測(cè)示意Fig.2 Schematic diagram of Pycl-NO2 (a),DFHBI-NF (b), coumarin-NTR (c) and NTR-AHC(d)in detecting endogenous NTR in vivo

傳統(tǒng)的熒光探針大多基于單一分析物的檢測(cè)，而近年來許多團(tuán)隊(duì)已開發(fā)出用于雙分析物或多分析物同時(shí)探測(cè)的熒光探針，從而提升醫(yī)學(xué)診斷的精準(zhǔn)性.Tian等[69]開發(fā)一種基于香豆素的新型熒光探針(NTR-AHC)用于同時(shí)檢測(cè)生物硫醇和NTR(圖2d).該探針在谷胱甘肽(GSH)和NTR同時(shí)存在下，在463 nm處產(chǎn)生了增強(qiáng)的熒光.

此外，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)特性的熒光探針在生物傳感應(yīng)用中引起了越來越多科研人員的興趣，特別是具有特異靶向性的熒光探針.與由于π-π堆積相互作用而在高濃度或固態(tài)下遭受熒光淬滅的常規(guī)熒光團(tuán)不同，AIE熒光團(tuán)(如四苯基乙烯(TPE))在聚集時(shí)，會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的發(fā)射，由于它們獨(dú)特的螺旋槳狀結(jié)構(gòu)，因此它們的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受到聚集狀態(tài)的限制，進(jìn)而阻止了通過非輻射通道的能量消散，從而導(dǎo)致了高量子產(chǎn)率[76-77].Liang等[78]合成了具有AIE特征的磷酸修飾四苯基乙烯熒光探針(TPE-phos)，用于檢測(cè)ALP及其酶活性(圖3a).與之前TPE基熒光探針工作相比[79-80]，在 ALP 存在下，與TPE-phos上的磷酸基團(tuán)識(shí)別并使其裂解，產(chǎn)生具有2個(gè)羥基的不溶性 TPE 殘基 (TPE-2OH).由于分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)機(jī)制受到限制，使其在水介質(zhì)中的熒光信號(hào)可以忽略不計(jì)，因此獲得了較高的信背景比，檢出限0.2 U/L.Zhang等[81]設(shè)計(jì)的高靈敏度的ALP熒光探針(TPEQN-P)，利用特異性AIE效應(yīng)也實(shí)現(xiàn)了ALP的檢測(cè)及其抑制劑的篩選(圖3b).由于TPEQN-P具有良好的水溶性，使其在水性介質(zhì)中表現(xiàn)出非常弱的發(fā)射.當(dāng) ALP 存在的情況下，TPEQN-P 發(fā)生去磷酸化并釋放出水解產(chǎn)物 TPE-QI，由于其水溶性較差，因此具有強(qiáng)烈的熒光特性，使其檢出限可低至0.007 7 U/L.同時(shí)，TPEQN-P在血清樣品中也顯示出良好的適用性，因此在臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究中顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值.

圖3 TPE-phos(a)和TPEQN-P(b)體內(nèi)內(nèi)源性ALP檢測(cè)示意Fig.3 Schematic diagram of TPE-phos (a) and TPEQN-P (b) in detecting endogenous ALP in vivo

3.2 近紅外(NIR)熒光探針生物酶檢測(cè)

近年來，近紅外(NIR,650～1 700 nm)熒光探針以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到研究者的青睞.NIR熒光探針具有較長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，較低的能量，更深的組織滲透性以及減少的自熒光背景干擾，已被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物組織的光學(xué)成像方面[82-83].NIR小分子熒光團(tuán)包括菁染料、卟啉衍生物、角鯊烯衍生物、BODIPY類似物和黃嘌呤等.其中菁染料(如Cy3、Cy5、Cy7、IR780和IR1048等)，具有摩爾吸收系數(shù)大、細(xì)胞毒性小和熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)[84-87].因此在細(xì)胞成像、動(dòng)物成像中已獲得廣泛應(yīng)用.

Nie等[88]制備了CyP探針分子來檢測(cè)內(nèi)源性ALP活性，已成功實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、組織和小鼠中ALP活性的分析(LOD為0.003 U/mL)(圖4a).Tan等[89]合成了一種基于DHXP的近紅外探針，用于靈敏檢測(cè)體內(nèi)外堿性磷酸酶的活性(圖4b).制備的NIR-DHXP顯示出良好的溶解性、高反應(yīng)活性、高細(xì)胞滲透性和顯著的近紅外發(fā)射，并且具有良好的生物相容性和快速細(xì)胞內(nèi)化能力的優(yōu)點(diǎn)，有望成為生物醫(yī)學(xué)研究的有用工具.此外，Gao等[90]開發(fā)了一種由七甲川花菁熒光團(tuán)和一個(gè)磷酸單酯構(gòu)成的近紅外探針(QcyP)，用于特異性檢測(cè)不同細(xì)胞系和荷瘤小鼠模型中的ALP水平(圖4c).該探針對(duì)ALP顯示出了很高的選擇性和靈敏度.更重要的是，該探針不僅可以區(qū)分不同細(xì)胞系中ALP的水平，而且可以區(qū)分肝腫瘤模型小鼠和正常小鼠ALP水平的變化.2019年，Lin課題組[91]開發(fā)了一種開啟式分子探針(LET-3)，通過近紅外熒光(NIRF)和光聲(PA)雙模成像觀察腫瘤組織中ALP的活性(圖4d).LET-3由近紅外半菁染料(LET-CyOH)和無磷酸部分組成，經(jīng)ALP活化后，在730 nm處NIRF增強(qiáng)23倍，在710 nm處PA增強(qiáng)27倍.體內(nèi)外診斷實(shí)驗(yàn)表明LET-3對(duì)ALP具有較高的敏感性和選擇性.這些發(fā)現(xiàn)為使用NIRF和PA雙通道開啟探針在體內(nèi)檢測(cè)ALP提供了一種很有前景的策略.

圖4 CyP(a)、DHXP(b)、QcyP(c)和LET-3(d)體內(nèi)內(nèi)源性ALP檢測(cè)示意Fig.4 Schematic diagram of CyP (a), DHXP (b), QcyP (c) and LET-3 (d) in detecting endogenous ALP in vivo

此外，Meng等[92]開發(fā)了第1個(gè)缺氧觸發(fā)和NTR酶響應(yīng)單分子探針，用于高對(duì)比度NIR Ⅱ/PA腫瘤成像和缺氧激活的光熱療法(圖 5a).該探針利用了基于熒光體上的硝基直接還原為氨的反應(yīng)機(jī)理.IR1048-MZ分子探針本身具有非常弱的NIR Ⅱ和PA信號(hào).然而，在缺氧腫瘤激活后，探針發(fā)出強(qiáng)烈的NIR Ⅱ熒光和PA信號(hào)，該信號(hào)提供了更準(zhǔn)確和更深的組織成像的腫瘤的位置和邊界.重要的是，IR1048-MZ的缺氧激活的光熱療法表現(xiàn)出卓越的光療功效，隨著溫度的快速增加，導(dǎo)致腫瘤消融，沒有復(fù)發(fā).2019年，Miao等[93]構(gòu)建了一種基于氰基結(jié)構(gòu)的頻率上轉(zhuǎn)換NTR探針(Cy7-NO2)用于識(shí)別體內(nèi)NTR活性(圖5b).該探針在850 nm處激發(fā)，在790 nm處發(fā)射.與其他檢測(cè)方法相比，探針的激發(fā)和發(fā)射區(qū)域在NIR區(qū)域中，可以增強(qiáng)組織穿透深度.此外，該探針可以通過較低的噪聲背景信號(hào)和更高的信噪比來增強(qiáng)體內(nèi)檢測(cè)能力和成像質(zhì)量.因此，Cy7-NO2預(yù)期是一種方便而有效的上轉(zhuǎn)換探針，以區(qū)分體內(nèi)缺氧腫瘤.

圖5 IR1048-MZ(a)和Cy7-NO2(b)體內(nèi)內(nèi)源性NTR檢測(cè)示意Fig.5 Schematic diagram of IR1048-MZ (a) and Cy7-NO2 (b) in detecting endogenous NTR in vivo

4 結(jié)論

熒光探針作為一種新興的腫瘤檢測(cè)、定性和手術(shù)指導(dǎo)的方法，它的高時(shí)空分辨率和非放射性的優(yōu)點(diǎn)尤其引人注目.利用亞微米尺度的空間分辨率，熒光成像實(shí)際上可以在單細(xì)胞分辨率下研究病理學(xué)，這對(duì)于早期腫瘤檢測(cè)和腫瘤手術(shù)是非常理想的.本文主要通過對(duì)具有安全性高、生物相容性好、光學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的有機(jī)小分子染料在不同腫瘤標(biāo)志物中的檢測(cè)進(jìn)行總結(jié)，并通過其熒光信號(hào)強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)酶活性的檢測(cè)，以期達(dá)到對(duì)早期腫瘤的實(shí)時(shí)檢測(cè).用于腫瘤成像的熒光探針的研制越來越引起人們的研究興趣，隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展和新設(shè)備的不斷涌現(xiàn)，熒光成像的研究范圍將不斷擴(kuò)大，有望為人類疾病診斷和治療提供一種嶄新的方法.