轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在單萜生物合成相關(guān)基因分析中的應用

嚴珂宇

摘要：東紫蘇ElsholtziabodinieriVaniot為唇形科香薷屬植物，又名小山茶、小香薷、鳳尾茶等，主產(chǎn)于云南、貴州西部。全草入藥，味苦、辛，性平，具有發(fā)散解表、清熱利濕的功效，用于感冒、咽喉痛、頭痛、扁桃腺炎、小兒口腔炎、牙痛、眼結(jié)膜炎、肝炎、消化不良等癥，是一種常見的彝藥。在滇南一帶以及滇中、滇西部分地區(qū)，東紫蘇的嫩葉或全株在民間被用來當茶飲已有悠久的歷史，有清熱解毒之效。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄組;數(shù)據(jù)挖掘;東紫蘇單萜生物合成;相關(guān)基因

引言

紫蘇主要分為9種化學型，主要依據(jù)紫蘇醛、檸檬烯、紫蘇酮、異白蘇烯酮、紫蘇烯、香薷酮等單萜的百分含量變化進行劃分。由此可見化學型的劃分主要是依據(jù)主成分含量的變化規(guī)律，因此本研究根據(jù)東紫蘇葉揮發(fā)油主成分1，8-桉葉油醇、α-乙酸松油酯及α-蒎烯、β-蒎烯含量的變化規(guī)律來劃分化學型是合理的。

1東紫蘇的概述

東紫蘇（ElsholtizabodinieriVaniot）又名鳳尾茶、小山茶、云松茶、牙刷草、野山茶等，來源于唇形科（Lamiaceae）香薷屬（Elsholtzia），主要分布于我國的云南、貴州省西部，四川、甘肅、青海等地區(qū)也有分布。東紫蘇全草入藥，味辛，性平，有發(fā)散解表、清熱利濕、理氣和胃的功效，用于外感風寒、頭疼身痛、咽喉痛、虛火牙痛、消化不良、急性結(jié)膜炎等癥。在云南民間有用其干燥嫩葉或全株泡水或煮水作為清熱解毒茶飲的傳統(tǒng)和習慣，是一種重要的民族民間藥。東紫蘇除揮發(fā)油外還含有黃酮類、三萜類、酚類等成分。對采自云南開遠的東紫蘇進行研究，發(fā)現(xiàn)黃酮含量較大（約為10%），葉部是黃酮主要存在部位，較少存在于根部。黃酮成分最高的3個化合物分別為圣草素7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷（含量最高，達5.1%），木犀草素7-O-β-D葡萄吡喃糖苷、山柰酚3-O-蘆丁糖苷。三萜類化合物主要集中在東紫蘇的莖部和根部（0.142%～0.189%），其中齊墩果酸類化合物為三萜類的主要成分（0.074%～0.197%）。東紫蘇含有迷迭香、沒食子酸、香草醛、咖啡酸、香草酸、甾醇、倍半萜、二萜苷和多種鐵、錳微量元素。

2.單萜類化合物的研究意義

單萜類化合物易被人體吸收然后轉(zhuǎn)移到血液中，具有治療多種疾病的功能。例如，左旋薄荷醇具有鎮(zhèn)咳、抑菌等作用，外用可以清涼止癢，內(nèi)服可以治療頭痛及鼻咽喉炎癥等。香葉醇是一種無環(huán)單萜，具有玫瑰香氣和廣泛的藥理作用，常被用于香水、化妝品、臨床抗癌藥物的生產(chǎn)，其價格為522元/100g，市場需求量也較大，根據(jù)新思界產(chǎn)業(yè)研究中心發(fā)布的《2020-2025年中香葉醇市場分析及發(fā)展前景研究報告》顯示，預計2025年中國香葉醇需求量將達到1000t。某些單萜烯及其衍生物，如單萜蒎烯和檸檬烯，具有較高的燃燒熱值、較低的凝固點，使它們可以成為汽油、柴油等傳統(tǒng)燃料的環(huán)保替代品。此外，還有一些單萜類化合物，如香芹酚和香葉烯，對微生物和昆蟲的毒害作用比較大，因此經(jīng)常被用作抗生素和殺蟲劑。因此，單萜化合物的高效合成在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要的意義。

3.東紫蘇揮發(fā)油的提取注意事項

單萜合酶基因克隆成功率低，并且轉(zhuǎn)錄組注釋的功能信息與東紫蘇揮發(fā)油GC-MS數(shù)據(jù)分析結(jié)果不吻合，即注釋的功能與揮發(fā)油的成分并不匹配，推測是受測序技術(shù)所限，以及數(shù)據(jù)庫可供比對的基因資源有限，增加了功能注釋的難度，致使一些東紫蘇揮發(fā)油單萜合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因未能得到精準拼接、組裝和注釋。此外，由于相同物種來源的單萜合酶的相似性高于不同物種來源而具有相同功能的單萜合酶，序列相關(guān)性并不直接轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物相關(guān)性，因此基于序列相似性僅可以判斷其是否為單萜合酶，卻不能預測其產(chǎn)物，所以已經(jīng)克隆成功的6個單萜合成相關(guān)候選基因需要進行功能驗證，確認其在東紫蘇揮發(fā)油單萜生物合成過程中的催化功能，才能確定該酶屬于哪一種單萜合酶，以便最終得到東紫蘇1，8-桉葉油醇合酶基因。

4.東紫蘇揮發(fā)油的提取

不同產(chǎn)區(qū)的東紫蘇揮發(fā)油從含量到成分組成有區(qū)別，原因可能來自以下幾方面。（1）東紫蘇來自不同產(chǎn)區(qū);（2）提取方法的不同得到不同化學成分的揮發(fā)油，有學者[39]認為水蒸汽蒸餾法提取的主要成分為桉素油（25%）;CO2-SFE提取得到的主要為氧化石竹烯和4-（1-甲基乙基）-苯甲醇，相對含量分別為5.57%和6.83%，而桉素油的相對含量僅為2.24%;（3）藥材的部位不同或者使用鮮品、干品的不同造成揮發(fā)油含量和成分的不同;（4）采收季節(jié)或時間的不同。因此，有必要在同一實驗條件對來自不同產(chǎn)地的東紫蘇揮發(fā)油進行研究，從而發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)東紫蘇揮發(fā)油含量及成分的異同。目前降血脂、抑菌活性、抗氧化和防衰老是東紫蘇的現(xiàn)代藥理學熱點，但文獻中記載的發(fā)散解表、清熱利濕、理氣和胃功效的藥效藥理學研究較少。東紫蘇在民間長期飲用的歷史悠久，應首先對其進行安全性評價，從而為其食品飲料、藥物制劑開發(fā)和臨床合理運用提供科學依據(jù)。

5.單萜類化合物上游合成途徑的強化

碳源進入微生物體內(nèi)被代謝合成IPP和DMAPP的過程。在原核生物中可通過自身的MEP途徑合成：以丙酮酸（Pyruvate）和3-磷酸甘油醛（DL-Glyceraldehyde3-phosphate，G3P）為前體，在5-磷酸脫氧木酮糖合成酶（1-Deoxy—D-Xylulose5-PhosphateSynthase，Dxs）催化下縮合形成脫氧木酮糖-5-磷酸（1-Deoxy—D-Xylulose5-Phosphate，DXP），5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（1-Deoxy—D-Xylulose5-Phosphatereductoisomerase，Dxr）催化DXP發(fā)生分子內(nèi)重排和還原反應生成甲基赤蘚醇-4-磷酸（MEP）。隨后，MEP經(jīng)4-二磷酸胞嘧啶-2-甲基赤蘚糖醇合酶（2-C-methyl-D-erythritol4-phosphatecytidylyhransferase，Ispd）、4-二磷酸胞嘧啶-2-甲基赤蘚糖醇激酶（2-C-methyl-Derythritol-4-phosphatekinase，Ispe）、甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合酶（2-C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphatesynthase，Ispf）、甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸還原酶（2-C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphatereductase，Ispg）和羥甲基-丁烯-4-焦磷酸還原酶（Hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphatereductase，Isph）五個酶的催化反應生成IPP和DMAPP。在真核生物中則是通過內(nèi)源的MVA途徑進行合成：乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）在乙酰乙酰輔酶A硫解酶（Acetoacetyl-CoAthiolase，Erg10）的催化作用下生成乙酰乙酰輔酶A，乙酰乙酰輔酶A在羥甲基戊二烯輔酶A還原酶（Hydroxymethylglutaryl-CoAsynthase，Erg13）的催化作用下生成羥甲基戊二酰輔酶A（Hydroxymethylglutaryl-CoA，HMG-CoA），HMGCoA接下來被羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（Hydroxymethylglutaryl-CoAreductase，Hmgr）還原生成甲羥戊酸（MVA），甲羥戊酸在甲羥戊酸激酶（Mevalonatekinase，Erg12）、磷酸甲羥戊酸激酶（Phosphomevalonatekinase，Erg8）、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（Mevalonatepyrophosphatedecarboxylase，Mvd1）以及異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyldiphosphateisomerase，Idi）的催化作用下生成IPP和DMAPP。然而，由于僅通過微生物自身的內(nèi)源反應合成的單萜產(chǎn)量遠不足以用于工業(yè)生產(chǎn)，因此，研究者通過設(shè)計和改造微生物的內(nèi)源代謝途徑或者引入異源代謝途徑來優(yōu)化上游途徑模塊，以獲得更多的前體物質(zhì)，從而強化微生物細胞中目標單萜類化合物的生產(chǎn)能力。

結(jié)束語

揮發(fā)油不同化學型可能具有不同的藥理活性，后續(xù)研究將關(guān)注東紫蘇葉揮發(fā)油不同化學型的藥理活性，同時將進行揮發(fā)油單萜合酶生物合成途徑的相關(guān)研究，為東紫蘇種質(zhì)資源評價篩選和品種選育提供理論指導。

參考文獻

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[2]毛媛，劉克武，劉克海，許劍鋒，呂慧.東紫蘇化學成分研究概述[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（03）：134-136.

[3]毛媛，呂留莊，劉克武，劉克海.東紫蘇（ElsholtizabodinieriVaniot）總黃酮的提取及其抗氧化、免疫活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2016，37（09）：85-88.