羅非魚酶解物礦物離子結(jié)合能力及其結(jié)合物抗氧化活性

張金楊,胡曉，李來好，3*，楊賢慶，吳燕燕，林婉玲，鄧建朝，榮輝，黃卉

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州， 510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海， 201306) 3(廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州，510300)

近年來，我國羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，產(chǎn)量和加工量逐年增長，穩(wěn)居世界前列。但加工品種較為單一，精深加工水平與高值化利用程度并不高。羅非魚產(chǎn)業(yè)正處于從規(guī)模產(chǎn)量型向質(zhì)量效益型轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期，對羅非魚原料進(jìn)行高值化加工利用，同時確保產(chǎn)品的質(zhì)量安全，是提高我國羅非魚產(chǎn)業(yè)競爭力的必由之路[1]。

鈣、鐵、鋅是人體必須的營養(yǎng)元素。人體對鈣、鐵、鋅元素的獲取主要來源于日常膳食中，但機體對元素的吸收利用受到多方面因素的影響。礦物離子結(jié)合肽與礦物離子形成的結(jié)合物能夠通過肽的吸收途徑轉(zhuǎn)運吸收，避免與氨基酸的競爭，促進(jìn)機體對礦物元素的吸收[2]。因此，以人體必需的礦物元素(如Ca2+、Fe2+、Zn2+等)與肽結(jié)合后所得結(jié)合物產(chǎn)品已成為一種新型礦物離子補充劑。此外文獻(xiàn)報道，礦物離子結(jié)合肽不僅具有促進(jìn)礦物離子吸收的活性，還可能具備較高的抗氧化、抗菌等生物活性[3]。

綜上所述，本實驗以羅非魚肉為原料，采用胰蛋白酶對其進(jìn)行酶解，研究酶解產(chǎn)物與Ca2+、Fe2+、Zn2+的結(jié)合活性，并對其結(jié)合物抗氧化活性進(jìn)行了分析。旨在為以羅非魚肉為原料制備礦物離子結(jié)合肽提供參考。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

羅非魚，購于廣州市華潤萬家超市。宰殺羅非魚，取羅非魚魚片用絞肉機絞成碎肉，置于聚乙烯袋中，-20 ℃保存。

1.2 實驗儀器與試劑

胰蛋白酶(800 U/g)，CaCl2、FeCl2、ZnCl2、三氯乙酸、Na2HPO4、NaH2PO4均為分析純，廣州市齊云生物有限公司。DPPH，美國Sigma公司；THZ-82型恒溫水浴振蕩箱，金壇精達(dá)儀器制造廠；3K30臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；Alpha1-4冷凍干燥機，德國Christ公司；Metrohm809型自動電位滴定儀，瑞士Metrohm；KjeltecTM2300蛋白自動分析儀，丹麥FOSS公司；Agilent 7900 ICP-MS，美國Agilent公司；SUNRISE吸光酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；Powerpac HV等點聚焦電泳儀，美國Bio-rad公司；Delta320精密pH計，梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司。

2 實驗方法

2.1 羅非魚蛋白酶解物的制備

取羅非魚肉，解凍，參考馬賽蕊[4]的方法，將羅非魚肉與去離子水以1∶2 (g∶mL)比例混勻，調(diào)節(jié)至pH 8.0后，加入胰蛋白酶，酶添加量為酶∶魚肉=3∶1 000(g∶g)，50 ℃下水浴振蕩酶解1、2、4、6、8 h，酶解至終點時置沸水中滅酶15 min，冷卻后于4 ℃、10 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液進(jìn)行抽濾、冷凍干燥后即得羅非魚肉蛋白酶解物。

2.2 水解度和蛋白回收率的測定

原料總氮含量和酶解液中總氮含量均采用半微量凱氏定氮法測定；酶解液中氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法測定。蛋白回收率按式(1)計算；水解度(DH)按式(2)計算。

(1)

(2)

2.3 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

膠的制備參照SCHAGGER等[5]的方法，膠由4%的濃縮膠，10%的間隙膠和16%的分離膠組成。酶解物與樣品緩沖液(0.4% SDS，12%甘油，50 mmol/L Tris, 0.01%溴酚藍(lán)，2%巰基乙醇，pH 6.8)按體積比1∶1混合，煮沸5 min。電泳結(jié)束后用為染色液(7%乙酸，40%體積分?jǐn)?shù)甲醇和0.125%體積分?jǐn)?shù)考馬斯亮藍(lán)R-250)著色2 h，用體積分?jǐn)?shù)分別為10%的乙酸，30%甲醇的脫色液脫色過夜，直到條帶清晰。

2.4 羅非魚蛋白礦物離子結(jié)合物的制備

參照范鴻冰[6]的方法并略作修改，本實驗選取鈣、鐵、鋅3種礦物離子與不同時間羅非魚肉蛋白酶解物進(jìn)行結(jié)合。配制5 mg/mL CaCl2、FeCl2、ZnCl2溶液，稱取一定量的酶解物溶于水中，按比例加入CaCl2、FeCl2、ZnCl2(酶解物與金屬鹽質(zhì)量比為20∶1)于37 ℃水浴40 min進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將溶液全部移入透析袋(100 Da)透析并記錄透析后溶液的總膨脹體積，透析液經(jīng)冷凍干燥即得結(jié)合物樣品。

2.5 結(jié)合率的測定

取一定體積的透析液于消化管，加入10 mL濃硝酸進(jìn)行微波消解，用超純水將消解液定容到50 mL，將上述溶液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，過0.45 μm的微孔濾膜后用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)測定溶液中的金屬離子含量，結(jié)合率按式(3)計算：

(3)

式中：C為透析后金屬離子的質(zhì)量濃度，μg/L；V為總膨脹體積，mL；m為加入金屬總質(zhì)量，mg；n為稀釋倍數(shù)。

2.6 抗氧化活性的測定

抗氧化活性主要從清除DPPH自由基和羥自由基的能力以及還原力來反映。

2.6.1 DPPH自由基清除率的測定

參照CHI等[7]的方法，并略作修改。取1 mL樣液，加入1 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液(用95%的乙醇溶解)，混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測吸光度(Ai)，空白組為1 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液，加入1 mL樣液混合，在517 nm波長處測定吸光度(Aj)，對照組為1 mL DPPH溶液加上1 mL 95%的乙醇，在517 nm波長處測定其吸光度(A0)。按式(4)計算DPPH自由基清除率。

(4)

2.6.2 羥自由基清除率的測定

參照DE AVELLAR等[8]的方法并略作修改,取0.3 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，加入0.2 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)和0.3 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，加入樣液1 mL混勻后，加入0.2 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的H2O2搖勻，37℃條件下水浴60 min，在波長536 nm波長處測其吸光度(A樣品)；以去離子水代替樣品和H2O2溶液重復(fù)上述操作，在536 nm波長處測其吸光度(A未損傷)；以去離子水代替樣液來重復(fù)以上操作，在536 nm波長處測得吸光度(A損傷)。清除率按式(5)進(jìn)行計算。

(5)

2.6.3 還原力的測定

參照OYAIZU[9]的方法并略作修改，取樣液1 mL，加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.6)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液1 mL混勻，在50 ℃水浴鍋內(nèi)保溫20 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液1 mL，振蕩混勻后10 000 r/min,4 ℃條件下離心10 min，取上清液1 mL，加入去離子水1 mL和0.1 g/100 mL的FeCl3溶液0.2 mL，振蕩混勻后在50 ℃水浴保溫10 min，等至體系溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色，然后在700 nm波長處測其吸光度。以去離子水代替樣品作為空白對照調(diào)零。

2.7 其他指標(biāo)的測定

羅非魚肉的水分含量參照GB/T 5009.3—2010，灰分含量參照GB 5009.4—2010，粗蛋白含量參照GB 5009.5—2010，粗脂肪含量參照GB 5009.6—2016的方法進(jìn)行測定，氨基酸組成分分析參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

2.8 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)設(shè)3個平行，采用Excel 2013和IBM SPSS Statisitics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 結(jié)果分析

3.1 基本組成成分

實驗所用羅非魚基本成分見表1，其中水分含量最高為79.28%，其次蛋白含量較高為20.32%，而脂肪含量相對較低，只有2%左右。因此羅非魚是一種高蛋白、低脂肪的魚類，比較迎合當(dāng)代人均衡飲食的理念。GHORBANI等[10]認(rèn)為羅非魚作為人類飲食的重要組成部分主要是因為其魚肉可以提供人類所必須的蛋白質(zhì)，日常飲食所需的必需氨基酸是決定高營養(yǎng)蛋白的主要因素，羅非魚肉是高營養(yǎng)和易消化蛋白的優(yōu)秀來源。此外，F(xiàn)OH等[11]指出羅非魚因其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)可以作為大多數(shù)海產(chǎn)品良好的替代品。

表1 羅非魚基本成分(濕重) 單位：%

3.2 水解度和蛋白回收率

酶解條件的差異導(dǎo)致水解度的不同，而不同的水解度影響著多肽的尺寸和氨基酸的組成，從而決定了酶解產(chǎn)物的生物活性。通過適當(dāng)?shù)牡鞍酌笇Φ鞍走M(jìn)行水解可以提高其生物活性，通過控制水解度可以更高效的獲得生物活性肽。KTARI等[12]發(fā)現(xiàn)烏賊的下腳料的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著水解度的增加呈正相關(guān)的趨勢。CHEN等[13]在牡蠣蛋白中鋅離子結(jié)合肽的純化和結(jié)構(gòu)特征的研究中發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物的鋅離子結(jié)合能力和水解度變化呈相同的趨勢。此外，WANG等[14]在小麥蛋白鈣離子結(jié)合肽的提取及其結(jié)合活性機理的研究中得出水解度的大小對鈣離子結(jié)合能力有著非常重要的作用。因此，為探究羅非魚酶解產(chǎn)物的礦物離子結(jié)合能力及抗氧化活性，對水解度的研究是很有必要的。

由圖1、圖2所示，在使用胰蛋白酶酶解羅非魚肉的過程中，水解度和蛋白水解度隨時間增加呈先上升后趨于平緩的趨勢。酶解時間為8 h時，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到10.7%和60.58%。在1～4 h之間，可能是酶活力較高且酶切位點較多，水解度和回收率明顯增加。但隨著水解時間的增加，酶切位點減少，水解度和蛋白回收率將不會持續(xù)增加。

圖1 不同酶解時間水解度的比較Fig.1 Comparison of DH of hydrolysates by different time

圖2 不同酶解時間蛋白回收率的比較Fig.2 Comparison of recovery rate of protein of hydrolysates by different time

3.3 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖3 羅非魚酶解產(chǎn)物的Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig.3 Tricine-SDS-PAGE Analysis of the hydrolysates of tilapia

電泳條帶見圖3，結(jié)果表明隨著酶解時間的增加，大分子條帶逐漸消失，也反映了水解度呈先上升后趨于平緩的趨勢。在制備生物活性肽時，過高或過低程度的水解是不利的，水解時間較短時，不能充分釋放相關(guān)肽段，而水解時間過長，會使多肽繼續(xù)水解成游離氨基酸。實驗所得各時間段的酶解物的分子量在4.6～26 kDa之間顯示了強條帶，這表明胰蛋白酶能夠從羅非魚肌肉蛋白中釋放出小尺寸肽。BHASKAR等[15]研究指出具有高營養(yǎng)價值的魚蛋白水解產(chǎn)物應(yīng)具有豐富的低分子量肽，酶解產(chǎn)物分子量的大小一定程度上決定其潛在的生物活性。

3.4 結(jié)合率

由圖4可知，胰蛋白酶酶解2 h所得酶解物與離子結(jié)合能力最高，其中與Ca2+的結(jié)合率達(dá)到78.71%，而Ca2+結(jié)合率要高于Fe2+、Zn2+?？赡苁谴藯l件下酶解物中的多肽片段或者氨基酸殘基更容易與Ca2+形成結(jié)合物。已有文獻(xiàn)報道，蛋白酶水解物具有結(jié)合礦物離子的能力。楊依然等[16]研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)圓鲹胰蛋白酶水解物Fe2+和Zn2+的螯合率分別高達(dá)96.63%和94.28%。JANET等[17]在研究菜豆以及菜豆蛋白水解物的抗氧化和金屬螯合活性中發(fā)現(xiàn)，菜豆的胰蛋白酶酶解物的鐵離子螯合活性達(dá)到81.22%。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶解時間超過2 h后，酶解物的礦物離子結(jié)合能力持續(xù)下降，原因可能是羅非魚魚肉蛋白持續(xù)水解，生成小肽或者更多的氨基酸，降低了礦物離子結(jié)合能力。

圖4 結(jié)合率測定結(jié)果Fig.4 Combination rate of the hydrolysates

3.5 氨基酸分析

目前，國內(nèi)外研究者們已經(jīng)從不同生物原料中提取了礦物離子結(jié)合肽，并進(jìn)行了分離純化以及結(jié)構(gòu)鑒定[18,21]。文獻(xiàn)顯示[22]，與礦物離子結(jié)合的肽主要依賴于氨基酸或肽的凈電荷，且從這些礦物離子結(jié)合肽的序列來看，大多含有具有帶電性質(zhì)的氨基酸，其中帶正電荷的如組氨酸、賴氨酸、精氨酸；帶負(fù)電的例如谷氨酸、天冬氨酸；或者是富含羥基的氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸。

羅非魚肉以及胰蛋白酶酶解液的氨基酸組成如表2所示，實驗結(jié)果顯示，羅非魚肌肉氨基酸含量較為豐富，其中谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸等氨基酸含量較高，因此，羅非魚是良好的制備礦物離子結(jié)合肽的原料。羅非魚肉經(jīng)胰蛋白酶水解后，谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、絲氨酸等與礦物離子結(jié)合能力有關(guān)的氨基酸含量大幅度增加。從酶解產(chǎn)物的氨基酸組成來看，胰蛋白酶可能是以羅非魚肉為原料制備一系列礦物離子結(jié)合肽的良好選擇。

表2 羅非魚胰蛋白酶酶解物與魚肉的氨基酸組成及含量 單位：g/100g

3.6 抗氧化活性

DPPH溶于乙醇后在517 nm波長處具有較為穩(wěn)定的最大吸光度，當(dāng)DPPH遇到供氫物質(zhì)時顏色從紫色變化為黃色而可視化，并且吸光度降低[23]。羥基是最活潑的自由基，可以在金屬離子如銅或鐵的存在下由超氧化物陰離子和過氧化氫形成。當(dāng)羥基自由基與芳族化合物反應(yīng)時，它可以通過雙鍵加成，產(chǎn)生羥基環(huán)己二烯基，所得到的自由基可以進(jìn)一步地反應(yīng)，例如與氧的反應(yīng)，得到過氧基，或通過除水分解成苯氧基型自由基[24]。

對礦物離子與酶解物的結(jié)合物進(jìn)行抗氧化活性測定，結(jié)果如表3所示，各組間具有顯著性差異(p<0.05)，Ca-酶解物顯示了最高的抗氧化活性，DPPH自由基清除率，羥自由基清除率和還原力分別為77.35%，32.51%和0.29。大量研究表明[25,28]，蛋白水解產(chǎn)物及與礦物離子結(jié)合后均具有較高的抗氧化活性。實驗所得酶解物顯示了較高的抗氧化能力，可能和氨基酸殘基、氨基酸序列以及疏水性有關(guān)。而結(jié)合物顯示了一定的抗氧化能力，可能是酶解產(chǎn)物中的小肽與金屬結(jié)合所需的活性基團(tuán)(如咪唑基、吲哚基和巰基等)，分別來源于組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等，這些氨基酸在抗氧化作用中發(fā)揮著重要的作用。

實驗所得酶解產(chǎn)物與礦物離子結(jié)合后抗氧化能力有所降低，可能是因為酶解物中多肽的氨基酸基團(tuán)與礦物離子結(jié)合后，減少了接受自由基的能力。此外，酶解物與不同的礦物離子結(jié)合后其抗氧化活性存在差異性，可見礦物離子結(jié)合物的抗氧化活性與離子類型有關(guān)，不同離子與酶解物的結(jié)合方式不同，導(dǎo)致了抗氧化活性的差異。

表3 結(jié)合物抗氧化活性測定Table 3 The antioxidant activities of Combinations

注：結(jié)合物抗氧化活性指標(biāo)組間分析采用Dunkun’s進(jìn)行差異性分析，以p<0.05為差異顯著，顯著性以a，b，c等字母表示。

4 結(jié)論

胰蛋白酶對羅非魚肉有一定的水解能力，蛋白回收率和水解度在酶解時間1～4 h之間明顯增加，4 h以后趨于平緩。當(dāng)酶解時間達(dá)到8 h時，水解度和蛋白回收率分別達(dá)到10.7%和60.58%。

羅非魚肉經(jīng)胰蛋白酶酶解2 h時所得酶解物與礦物離子結(jié)合能力最高，Ca2+的結(jié)合率達(dá)到78.71%，且此條件下酶解物的礦物離子結(jié)合能力Ca2+>Fe2+>Zn2+。具有高礦物離子結(jié)合活性的酶解產(chǎn)物中谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、絲氨酸含量較高。酶解產(chǎn)物與結(jié)合物均顯示了一定的抗氧化活性，酶解產(chǎn)物與礦物離子結(jié)合后抗氧化能力有所降低，其中Ca-酶解物的抗氧化活性顯著高于Fe-酶解物和Zn-酶解物(p<0.05)。

[1] 陳勝軍,李來好,楊賢慶,等.羅非魚綜合加工利用與質(zhì)量安全控制技術(shù)研究進(jìn)展[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2011,7(4):85-90.

[2] GUO Li-dong, HARNEDY P A, LI Ba-fang, et al.Food protein-derived chelating peptides: bio-functional ingredients for dietary mineral bioavailability en-hancement[J].Trends in Food Science & Technology,2014,37(2):92-105.

[3] 王子懷,胡曉,李來好,等.肽-金屬離子螯合物的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2014,35(8):359-362.

[4] 馬賽蕊,胡曉,吳燕燕,等.羅非魚肉蛋白酶解液的抗氧化活性[J].食品科學(xué),2012,33(19):52-56.

[5] SCHAGGER H, JAGOW G.Tricine-sodium dodecyl sulfate-poly-acylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range form 1 to 100 kDa[J].Anal Biochem,1987,66(2):368-379.

[6] 范鴻冰,汪之穎,劉鵬,等.鰱魚骨膠原多肽螯合鈣的制備研究[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2014,10(2):72-71.

[7] CHI Chang-feng, HU Xin-yuan, WANG Bin, et al.Antioxidant and anticancer peptides from theprotein hydrolysate of blood clam (Tegillarcagranosa) muscle[J].Journal of Functional Foods,2015，15:301-313.

[8] DE AVELLAR I G, MAGALHES M M, SILVA A B, et al.Reevaluating the role of 1,10-phenanthroline in oxidative reactions involving ferrous ions and DNA damage[J].Biochimica et Biophysica Acta,2004(1675):46-53.

[9] OYAIZU M.Studies on product browning reaction prepared from glucose amine[J].Japanese Journal of Nutrition,1968(44):307-315.

[10] GHORBANI M, MIRAKABAD H Z.Factors influencing on trout production in Khorasan Razavi Province[J].Trends in Agricultural Economics, 2010(1):19-27.

[11] FOH M B K, AMADOU I, KAMARA M T, et al.Effect of enzymatic hydrolysis on the nutritional and functional properties of nile Tilapia (Oreochromis niloticus) proteins[J].American Journal of Biochemistry & Molecular Biology, 2011, 1(1):54-67.

[12] KTARI N, FAKHFAKH N, BALTI R, et al.Effect of degree of hydrolysis and protease type on the antioxidant activity of protein hydrolysates from Cuttlefish (Sepia officinalis) by-products[J].Journal of Aquatic Food Product Technology, 2013, 22(5):436-448.

[13] CHEN D, LIU Z, HUANG W, et al.Purification and characterisation of a zinc-binding peptide from oyster protein hydrolysate[J].Journal of Functional Foods, 2013, 5(2):689-697.

[14] WANG L, DING Y, ZHANG X, et al.Isolation of a novel calcium-binding peptide from wheat germ protein hydrolysates and the prediction for its mechanism of combination.[J].Food Chemistry, 2018, 239:416-426.

[15] BHASKAR N, BENILA T, RADHA C, et al.Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of Catla (Catla catla) for preparing protein hydrolysate using a commercial protease[J].Bioresource Technology,2008,99(2):335-343.

[16] 楊伊然,胡曉,楊賢慶,等.藍(lán)圓鲹蛋白酶解物的螯合礦物離子活性研究[J].食品科學(xué),2017,38(3):88-93.

[17] JANET C, ALAN J H, CRISTIAN J, et al.Antioxidant and metal chelating activities of peptide fractions from phaseolinand bean protein hydrolysates[J].Food Chemistry,2012,135(13):1 789-1 795.

[18] WANG Chan, LI Bo, AO Jing.Separation and identification of zinc-chelating peptides from sesame protein hydrolysate using IMAC-Zn2+and LC-MS/MS[J].Food Chemistry, 2012, 134(2): 1 231-1 238.

[19] ZHAO Li-na, HUANG Shun-li, CAI Xi-xi , et al.A specific peptide with calcium chelating capacity isolated from whey protein hydrolysate[J].Journal of Functional Foods,2014,10(3):46-53.

[20] HUANG Guang-rong, REN Zhang-yan, JIANG Jia-xin.Separation of iron-binding peptides from shrimp processing by-products hydrolysates [J].Food Bioprocess Technology,2011,4(8):1 527-1 532.

[21] SETH A, MAHONEY R R.Iron chelation by digests of insoluble chicken muscle protein: the role of histidine residues[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(2): 183-187.

[22] CHAUD M V, IZUMI C, NAHAAL Z, et al.Iron derivatives from casein hydrolysates as a potential source in the treatment of iron deficiency[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(4):871-877.

[23] SHIMADA K,FUJIKAWA K,YAHARA K, et al.Antioxidative properties of xanthan on the antioxidation of soy bean oil in cyclodextrin emulsion[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992,40(6):945-948.

[24] LEE J, KOO N, MIN D B.Reactive oxygen species, aging, and antioxidant nutraceuticals[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2004,3(1):21-33.

[25] 曹榮,李冬燕,劉淇,等.刺參腸、性腺酶解多肽體外抗氧化作用研究[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2013,9(6):47-51.

[26] 林慧敏,張賓,鄧尚貴,等.舟山海域4種低值魚酶解蛋白亞鐵螯合物自由基清除活性與抑菌活性研究[J].中國食品學(xué)報,2012,13(1):19-24．

[27] ZHOU Da-yong, TANG Yue, ZHU Bei-wei, et al.Antioxidant activity of hydrolysates obtained from scallop (Patinopectenyessoensis) and abalone (Haliotis discus hannai Ino)muscle[J].Food Chemistry,2012,132(2):815-822.

[28] 李同剛.羅非魚下腳料蛋白酶解物鋅螯合鹽的制備及其抗氧化活性研究[D].湛江:廣東海洋大學(xué),2013.