基于ISSR分子標記的湖北野生夏枯草遺傳資源分析

董元火白雪依廖新安夏恒建張文才王圣軍彭仕梅郭雙喜

(1.江漢大學生命科學學院/湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術研究中心，湖北 武漢 430056；2.湖北省蘄春縣科學技術和經(jīng)濟信息局，湖北 蘄春 435399；3.李時珍醫(yī)藥集團有限公司，湖北 蘄春 435399；4.蘄春縣中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，湖北 蘄春 435399)

2021年7月9日，習近平總書記主持召開中央全面深化改革委員會第二十次會議，審議通過了《種業(yè)振興行動方案》。會議強調必須推進種業(yè)振興，必須把民族種業(yè)搞上去，把種源安全提升到關系國家安全的戰(zhàn)略高度，實現(xiàn)種業(yè)科技自立自強、種源自主可控。

種質資源，又稱遺傳資源或基因資源，是培育作物和中藥材優(yōu)質、高產(chǎn)的物質基礎，是維系國家食物和藥品安全的重要保證[1]。中醫(yī)藥作為我國獨特的衛(wèi)生資源，在經(jīng)濟社會發(fā)展和促進人類健康中發(fā)揮著重要作用。種質資源是中藥材生產(chǎn)的源頭，種質的優(yōu)劣對中藥材產(chǎn)量和質量有決定性作用[1]。種質資源的遺傳多樣性是其影響中藥材質量的根本內在機理，研究保存物種的遺傳多樣性對其種質資源的保護與利用以及育種有重要意義[2]。保護遺傳多樣性是生物多樣性保護工作中最根本的任務，也是實現(xiàn)可持續(xù)利用發(fā)展戰(zhàn)略的基本保障。

夏枯草(Prunella vulgaris L.)隸屬唇形科夏枯草屬，因“夏至后即枯”得名，是常見傳統(tǒng)中藥之一。干燥果穗是主要的藥用部位，干燥果穗入藥稱“夏枯球”，全草入藥稱“夏枯草”。有清熱明目、瀉肝火、清熱散結、降壓、降糖、抗菌、抗炎、抗過敏、抗病毒及增強免疫力等功效[3]。2011年已被湖北省科技廳列為全省優(yōu)先發(fā)展的3大主要優(yōu)勢品種之一[4]。蘄春夏枯草，為國家地理標志產(chǎn)品，是蘄春精準脫貧的重要產(chǎn)業(yè)。

目前，夏枯草的研究主要涉及藥材鑒別、化學成分、藥理作用、產(chǎn)品開發(fā)、生態(tài)學和種植等方面[4,5-10]，而夏枯草野生遺傳資源的狀況和評價研究報道相對較少，董元火等[11]基于迷迭香酸的含量評價了湖北夏枯草野生種質資源。中藥材野生品與栽培品的研究表明，野生與栽培藥材既存在差異又體現(xiàn)共性；野生品與栽培品既有質量差異大的品種，如丹參、天麻、魚腥草等[12-14]，又有質量等同的品種，如防風、黃芩等[15,16]，這與種質資源密不可分。種質資源是藥材生產(chǎn)的源頭，種質的優(yōu)劣對產(chǎn)量和質量具有決定性的影響。本研究擬基于ISSR分子標記的遺傳多樣性評價野生夏枯草種質資源，為夏枯草種質資源保護和品種改良、中藥材品質的提高奠定基礎，助力夏枯草產(chǎn)業(yè)在鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的材料分別采自湖北的武漢、蘄春、襄陽和崇陽4個地方。根據(jù)研究所需，保證取樣間距5m以上，隨機采取夏枯草幼嫩葉片并用硅膠保存。提取夏枯草干燥葉片中的DNA，保存于-20℃冰箱中。由于襄陽和崇陽種群相對較小，因此該兩種群所取樣本較少。具體樣品數(shù)及相關信息見表1。

表1 基于ISSR分析的4個野生夏枯草種群的樣品信息

1.2 試驗方法

1.2.1 夏枯草基因組DNA的提取及檢測

采用改進的CTAB法[17]提取夏枯草葉片中的基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀(Eppendorf BioPhotometer plus，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)分別測定其純度和濃度，選取260/280處OD值在1.8～1.9的DNA樣品進行ISSR-PCR擴增及分析。

1.2.2 ISSR-PCR擴增

從4個夏枯草種群中分別取1個DNA樣品，共選取4個DNA樣品進行引物篩選，所用ISSR引物是加拿大哥倫比亞大學公布設計的序列，具體見表2。PCR擴增后，對比可重復性、多態(tài)性及清晰度后，篩選確定擴增效果良好的引物。采用的PCR擴增儀為PTC-100TMthermocycler(MJ Research，Inc)。PCR反應體系參考廖麗等[18]研究方法，并作適當改進。

ISSR-PCR反應體系(25μL)：含有13μL雙蒸水，2.5μL(2.5mmol·L-1)dNTP，2.5μL 10×PCR Buffer(含10mmol·L-1Tris-HCl，1.5mmol·L-1MgCl2和50mmol·L-1KCl)，1.0μL(25mmol·L-1)MgCl2，0.5μL Taq Polymerase，1.5μL引物(25pmol)，4μL模版DNA。

PCR反應參數(shù)：94℃預變性5min；接35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃變性30s，53℃復性(退火)45s，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸7min。

DNA樣品PCR擴增完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將ISSR-PCR產(chǎn)物電泳所有的條帶進行統(tǒng)計，同一位點條帶有標記為1，無標記為0。采用POPGENE32軟件[19]進行數(shù)據(jù)分析，主要統(tǒng)計參數(shù)包括多態(tài)位點百分率(PPB)、Nei′s基因多樣性(Ht)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、遺傳一致性和遺傳距離。采用MEGA7.0.26軟件，基于Nei′s的遺傳距離，構建4個種群的UPGMA聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR有效引物

從50個引物中，根據(jù)可重復性、多態(tài)性及清晰度，篩選確定擴增效果良好的9個引物，具體見表2。

表2 ISSR引物序列以及每條引物擴增帶的情況

2.2 PCR擴增結果

利用篩選出的引物對夏枯草所有21個樣品進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)檢測顯示，其檢測部分結果如圖1所示。

圖1 引物809對部分DNA樣品擴增的ISSR電泳圖

2.3 遺傳多樣性

根據(jù)凝膠電泳圖譜條帶，采用POPGENE32分析顯示，武漢種群內(WHX)和蘄春種群(QCX)多態(tài)性位點(PPB)分別為78.95%和75.44%，2個種群的遺傳多樣性比較高，而崇陽種群(CYX)遺傳多樣性最低，多態(tài)性位點為43.86%，具體見表3。4個種群總共的多態(tài)性位點為98.25%，物種水平Nei′s基因多樣性(Ht)和Shannon′s信息指數(shù)(I)分別為0.37和0.54。QCX和WHX種群間的遺傳一致性最大(0.8972)，與2個種群間遺傳距離最小的結果相吻合。CYX與QCX種群間的遺傳一致性最小(0.7323)，與之相適應的二者間的遺傳距離性最大(0.3115)，其結果也相互應證。基于Nei′s的遺傳距離UPGMA聚類圖顯示崇陽種群(CYX)單獨分為一支，具體見圖2。

表3 基于ISSR標記分析的4個夏枯草種群遺傳多樣性水平

表4 4個種群的Nei氏遺傳一致性和遺傳距離

圖2 基于Nei′s遺傳距離的4個野生夏枯草種群的

3 討論與結論

種質資源遺傳多樣性是利用基因資源的基礎和引種、栽培及資源保護的基礎。從資源保護和利用的角度，必須要盡量多地保留遺傳多樣性[20]。在本研究中，ISSR分析顯示武漢種群內多態(tài)性位點有78.95%，蘄春種群內多態(tài)性位點有75.44%，襄陽種群內多態(tài)性位點有52.63%，崇陽種群內多態(tài)性位點為43.86%，表明武漢和蘄春的野生夏枯草的遺傳多樣性較高。因此，要更好地保護其高的遺傳多樣性種群，同時，在開展夏枯草“野轉家”種植時應該優(yōu)選考慮蘄春和武漢各種群夏枯草種植及技術研究，有效解決因長期人工大規(guī)模種植導致的產(chǎn)量和品質下降的問題。4個種群總共的多態(tài)性位點有98.25%，物種水平Nei′s基因多樣性(Ht)和Shannon′s信息指數(shù)(I)分別為0.37和0.54，表明夏枯草在物種水平存在高水平的遺傳多樣性，具體見表3。與沈宇峰等[21]利用AFLP分子標記技術研究的夏枯草種質資源遺傳多樣性中揭示的多態(tài)位點百分率93.91%結果相似，這說明基于ISSR分子標記的遺傳多樣性分析結果相對比較可靠，該技術可以有效運用在大多數(shù)植物的遺傳多樣性分析中。物種適應環(huán)境和保持進化潛力的物質基礎是遺傳變異，一個物種的分布廣泛與否、種質資源豐富與否都與該物種自身的遺傳多樣性有關。本研究顯示，武漢種群和蘄春的夏枯草的多態(tài)位點百分率高，表明遺傳多樣性較高，遺傳資源豐富，而崇陽夏枯草多態(tài)位點百分率最低，為43.86%，遺傳多樣性最低，遺傳資源相對不豐富，與崇陽夏枯草種群較小(種群面積20～30m2)有關。因此，要通過種群更新、恢復、擴繁及野生種質資源交流，提高其遺傳多樣性。