深縣豬全基因組選擇信號(hào)檢測(cè)分析

劉 刁，蘆春蓮，李 尚，賈夢(mèng)雨，任麗琴，李 賽，曹洪戰(zhàn)*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.張家口市萬全區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河北張家口 0762503；3.河北正農(nóng)牧業(yè)有限公司，河北辛集 052360）

我國地域遼闊，地形復(fù)雜，擁有豐富的豬遺傳資源庫。深縣豬作為河北省現(xiàn)存的唯一地方黑豬，具有肉質(zhì)好、耐粗飼、繁殖性能高等特點(diǎn)。為了更好地利用深縣豬種質(zhì)資源及對(duì)這一品種進(jìn)行保護(hù)，我國學(xué)者和研究人員開展了一系列的遺傳選育研究工作。例如，在選育過程中計(jì)算各世代的近交系數(shù)，結(jié)合仔豬生長性能和母豬繁殖性能的變異系數(shù)掌握近交程度，可以防止出現(xiàn)近交衰退，提高選育速度，加速深縣豬遺傳進(jìn)展，使群體中的優(yōu)良基因迅速純合，并淘汰掉不利基因，從而達(dá)到親本優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳給下一代的選育效果[1]；利用微衛(wèi)星位點(diǎn)標(biāo)記分析深縣豬群體遺傳多樣性，并計(jì)算各家系在微衛(wèi)星位點(diǎn)標(biāo)記上的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離，為分析育種改良潛力奠定基礎(chǔ)[2-3]。隨著單核苷酸多態(tài)性（SNP）芯片和全基因組重測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，從分子層面揭示畜禽遺傳多樣性的研究日益普遍。有研究表明，中國南方豬與北方豬的表型特征也存在較大差異[4]，同時(shí)與深縣豬選擇信號(hào)檢測(cè)的相關(guān)研究相對(duì)匱乏，因此需要進(jìn)一步研究。本文通過對(duì)深縣豬進(jìn)行全基因組選擇信號(hào)分析，并與南方太湖豬的一個(gè)品系——梅山豬對(duì)比，探究深縣豬的分子遺傳特點(diǎn)，為深縣豬的保種選育工作提供生物信息學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所用深縣豬來自河北正農(nóng)牧業(yè)有限公司深縣豬保種場(chǎng)。隨機(jī)選取10 頭35 日齡以上的斷奶仔豬，斷奶體重8 kg 左右，對(duì)豬耳組織剪毛并用75%酒精消毒，使用耳標(biāo)鉗采集約100 mg 的耳組織樣本，樣本保存于裝有95%酒精的EP 管中，使用冰袋運(yùn)輸帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-20℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取及重測(cè)序 將深縣豬耳組織樣品送到北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因重測(cè)序?；贗llumina 技術(shù)測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序（Paired-END）的方法，測(cè)序策略采用Illumina PE150，完成10 個(gè)深縣豬DNA 樣品的全基因組重測(cè)序。

1.2.2 選擇信號(hào)檢測(cè) 在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行選擇性消除分析，采用群體分化指數(shù)（Fst）和核酸多樣性（θπ）相結(jié)合的檢測(cè)策略，取共同鑒定到的區(qū)域作為候選的受選擇區(qū)域，并提取相應(yīng)區(qū)域內(nèi)的變異位點(diǎn)信息。采用滑動(dòng)窗口法進(jìn)行Fst 的計(jì)算。利用R 語言計(jì)算出深縣豬每個(gè)SNP 位點(diǎn)與梅山豬相對(duì)應(yīng)的SNP 位點(diǎn)的Fst 值，然后通過使用窗口大小100 000 bp、步長10 000 bp 的滑動(dòng)窗口計(jì)算出每個(gè)窗口內(nèi)所有SNP 位點(diǎn)Fst 值的總和，除以每個(gè)窗口內(nèi)的SNP 數(shù)量，得到每個(gè)窗口的平均Fst值，之后將深縣豬與梅山豬相對(duì)應(yīng)的窗口平均Fst 值進(jìn)行比較，將差異最大和最小的Fst 值分別作為maxFst和minFst，從而確定深縣豬分化差異明顯的染色體區(qū)段。計(jì)算公式如下：

采用滑動(dòng)窗口法對(duì)每個(gè)群體分別進(jìn)行θπ 值的計(jì)算，然后計(jì)算2 個(gè)群體θπ 的比率（θπ Ratio）。公式如下：

1.2.3 候選位點(diǎn)基因注釋及功能富集分析 從Ensembl數(shù)據(jù)庫中下載目標(biāo)物種基因注釋文件，將篩選出的受選擇位點(diǎn)定位到基因。使用DAVID 在線生物信息網(wǎng)站[5]進(jìn)一步對(duì)基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology,GO）功能富集及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encycloprdia of Genes and Genomes Pathway,KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組重測(cè)序 本研究基于全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)10 頭深縣豬進(jìn)行了測(cè)定分析，獲得了測(cè)序深度達(dá)10倍、有效數(shù)據(jù)總量為280G 的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，平均86% 以上的數(shù)據(jù)能夠比對(duì)到參考基因組。測(cè)序質(zhì)量Q20 ≥95.42%，Q30 ≥89.46%，GC含量在42.10% 和42.96% 之間，沒有發(fā)生堿基分離的現(xiàn)象（表1）。10頭梅山豬全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)從NCBI 數(shù)據(jù)庫中的SRA數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nhm.nih.gov/sra）中下載。

表1 深縣豬全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)

2.2 SNP 變異檢測(cè)結(jié)果 深縣豬共檢測(cè)到28 169 424 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，通過Annovar 軟件進(jìn)行注釋，得到深縣豬SNP 所在基因區(qū)域及類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：基因上游1 kb區(qū)域和下游1 kb 區(qū)域SNP 含量分別為0.75%和0.87%，基因間區(qū)域SNP 含量為45.84%，外顯子和內(nèi)含子SNP含量分別為0.85%和51.69%。梅山豬（MS）共檢測(cè)到5 529 160 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，其中基因上游1 kb 區(qū)域和下游1 kb 區(qū)域SNP 含量分別為0.49% 和0.70%，基因間區(qū)域含量為43.21%，外顯子和內(nèi)含子平均含量分別為1.05%和52.24%。將深縣豬和梅山豬測(cè)得的SNP 在基因組區(qū)域分布繪制成群體特異SNPs 分布圖（圖1），可以發(fā)現(xiàn)多數(shù)SNP 位點(diǎn)位于基因的非編碼區(qū)，即基因間區(qū)域和內(nèi)含子，位于基因編碼區(qū)外顯子的SNP 僅占1%左右。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了高質(zhì)量多態(tài)性SNP 標(biāo)記在染色體上的數(shù)量和密度分布。結(jié)果表明，SNP 標(biāo)記覆蓋11 條染色體，并且在染色體上的分布并不均勻。相對(duì)于梅山豬，深縣豬獨(dú)有的變異位點(diǎn)有21 602 538 個(gè)，并且15號(hào)染色體上的選擇變異較多（圖2）。

2.3 選擇信號(hào)檢測(cè)與候選基因篩選 篩選同時(shí)出現(xiàn)在Fst 滑窗分析1% 的窗口和θπ Ratio 分析TOP 1% 中的位點(diǎn)（圖3、圖4），共獲得580 個(gè)高質(zhì)量的多態(tài)性SNP，定位于23 個(gè)基因，篩選出強(qiáng)選擇信號(hào)基因7 個(gè)，基因功能涉及生殖、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、免疫等方面（表2）。

圖3 Fst 曼哈頓圖

圖4 θπ 曼哈頓圖

表2 深縣豬群體信號(hào)選擇區(qū)域

2.4 候選基因GO 和KEGG 分析 對(duì)候選基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明：候選基因富集到分子功能、細(xì)胞組分和生物過程3 大類，共182 條GO 條目。選取顯著富集（P＜0.05）的條目作圖發(fā)現(xiàn)，富集到分子功能、細(xì)胞組分和生物過程的條目分別有3、8 條和10 條（圖5），涉及到的基因有CPEB2、EIF3A、PDLIM3、SNX10。

圖5 GO 富集分析圖

對(duì)候選基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果表明：候選基因富集到的KEGG 通路有53 條，其中顯著富集的通路有16 條，涉及到的基因有ADCY8、CPEB2、MS4A2、TACR1（表3）。其中ADCY8、CPEB2、TACR1基因極顯著富集到與繁殖性能相關(guān)的通路（P＜0.01）。

表3 KEGG 富集分析

3 討 論

遺傳分化是生物長期進(jìn)化的產(chǎn)物，Wright 認(rèn)為當(dāng)0＜Fst＜0.05 時(shí)，表明群體間遺傳分化程度很小[6]。本研究中，深縣豬和梅山豬的平均Fst 值為0.174 6，說明深縣豬和梅山豬之間的遺傳分化程度較高。由于所受選擇強(qiáng)度和選擇方向不同，主要在外貌特征和生產(chǎn)性能上表現(xiàn)出較大的遺傳差異。在23 個(gè)候選基因中，有7 個(gè)與肉質(zhì)、繁殖和免疫性狀相關(guān)，說明在品種選育過程中，相對(duì)于梅山豬，深縣豬在肉質(zhì)、繁殖及免疫性狀上經(jīng)歷了人工選擇。

已有研究能將肉質(zhì)性狀的QTL 進(jìn)行定位，并找到相關(guān)連鎖的SNP 進(jìn)行標(biāo)記[7-9]，關(guān)于豬肉質(zhì)性狀的QTL更多定位于15 號(hào)染色體上[10-11]。本研究基于全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)深縣豬進(jìn)行選擇信號(hào)分析，獲得的SNP在染色體上的數(shù)量和密度分布并不均一，與梅山豬對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PDLIM3基因的突變位點(diǎn)最多。PDLIM3即PDZ和LIM 結(jié)構(gòu)域蛋白3（PDZ And LIM Domain 3），也稱為ALP，是一種肌節(jié)基因[12]，定位于15 號(hào)染色體。Wang 等[13]人通過構(gòu)建豬PDLIM3 蛋白的3 種不同亞型的過表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)豬PDLIM3 蛋白在豬肌纖維生長和發(fā)育中發(fā)揮作用。SNX10 是一種磷酸磷脂酰肌醇3-磷酸結(jié)合蛋白，在脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用。研究表明，深縣豬擁有優(yōu)良的肉質(zhì)性狀[14]，結(jié)合本文研究結(jié)果不難推測(cè)，這可能與深縣豬PDLIM3和SNX10的突變有關(guān)。

繁殖性狀屬于豬生產(chǎn)上的重要性狀之一，與經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān)，但深縣豬繁殖性能總體上遺傳穩(wěn)定性較差，繁殖性狀又大多受數(shù)量性狀基因控制，但目前的SNP 芯片技術(shù)不足以進(jìn)行豬數(shù)量性狀的定位研究。本研究通過選擇信號(hào)檢測(cè)，篩選出與繁殖性能相關(guān)的候選基因：CPEB2、TACR1、ADCY8，揭示了深縣豬繁殖性狀的分子調(diào)控機(jī)制。CPEB2是CPEB 蛋白家族的新成員，作為卵子發(fā)生和精子發(fā)生中的轉(zhuǎn)錄因子，在配子發(fā)生過程中，通過細(xì)胞質(zhì)聚腺苷酸化控制特定mRNA 翻譯，從而發(fā)揮基本作用[15]。CPEB2基因突變?cè)谏羁h豬上受到選擇，可能對(duì)提高受精率有重大意義。TACR1是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其編碼的NK1R 蛋白是TAC1的受體之一，而TAC 通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)動(dòng)物卵巢排卵和妊娠等生殖過程[16]，本研究中TACR1基因顯著富集到鈣離子信號(hào)通路（Calcium Signaling Pathway）上，已有研究表明鈣離子信號(hào)通路在山羊繁殖過程中發(fā)揮著重要作用[17]，因此可以推測(cè)TACR1基因通過參與鈣離子信號(hào)通路影響深縣豬的繁殖過程。ADCY8基因參與雌激素信號(hào)通路[18]，它受雌激素受體和雌激素的正向調(diào)節(jié)，而雌激素能夠有效刺激乳腺細(xì)胞生長發(fā)育[19]。Zhang 等[20]研究推測(cè)ADCY8在子宮內(nèi)膜接受能力中發(fā)揮著重要作用,可能會(huì)提高子宮內(nèi)膜的接受能力，促進(jìn)胎兒著床。深縣母豬窩產(chǎn)仔數(shù)高以及高泌乳力可能與ADCY8基因受到選擇有關(guān)。

本研究篩選出了與免疫性狀相關(guān)的基因：EIF3A和MS4A2。先前的研究表明EIF3A是管家基因，但最近的研究發(fā)現(xiàn)EIF3A與腫瘤癌癥發(fā)生和耐藥性密切相關(guān)[21-23]。MS4A2基因參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有免疫應(yīng)答FcεRI 途徑和鞘磷脂信號(hào)傳導(dǎo)途徑，研究證實(shí)與哮喘病密切相關(guān)[24-25]。相對(duì)于梅山豬，這2 種基因在深縣豬上受到選擇，或許對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)能力至關(guān)重要。

4 結(jié) 論

本研究利用深縣豬和梅山豬2 個(gè)群體的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)深縣豬進(jìn)行群體選擇信號(hào)分析，檢測(cè)到受選擇區(qū)域580 個(gè)，落入這些區(qū)域的候選基因有23 個(gè)，選擇信號(hào)較強(qiáng)的基因有7 個(gè)，分別富集到生殖、細(xì)胞作用、代謝及免疫相關(guān)的通路上。本研究結(jié)果表明，相對(duì)于梅山豬，深縣豬在肉質(zhì)、繁殖及免疫性狀上經(jīng)歷了人工選擇，這為深縣豬的遺傳選育工作提供了新思路。

致謝：感謝河北省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新體系項(xiàng)目的資助，感謝河北正農(nóng)牧業(yè)有限公司提供的研究樣本，也感謝工作人員幫助收集樣品。感謝實(shí)驗(yàn)室每一位成員的辛苦付出。