黔北麻羊PPP3CA基因克隆、生物信息學(xué)分析及不同組織表達研究

惠茂茂，陳 祥*，敖 葉，周志楠

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊作為貴州省三大山羊品種之一，其在生態(tài)學(xué)特征、體質(zhì)外貌特征、生理指標、生產(chǎn)性能、繁殖性能等方面均具有諸多特點[1]，尤其在肉質(zhì)優(yōu)良特性方面具有較高的開發(fā)價值[2]。羊肉肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛[3]。羊骨骼肌是主要食用部分，占機體干重的40%～50%[4]。肌纖維是構(gòu)成動物骨骼肌組織的基本單元，是肌肉生長的重要參數(shù)。鈣調(diào)磷酸酶是影響肌纖維的重要信號分子。蛋白磷酸酶3（Protein Phosphatase 3，PPP3）又稱鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN）是受Ca2+/ 鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由1 個催化亞單位（PPP3 Catalytic Subunit，PPP3C）和1 個調(diào)節(jié)亞單位（PPP3 Regulatory Subunit，PPP3R）組成的異源二聚體[5-6]。在脊椎動物中PPP3C有PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC3 個亞單位，其中PPP3CA 和PPP3CB 在機體內(nèi)分布廣泛[7-9]，PPP3CA在腦和心血管系統(tǒng)中分布最多。在骨骼肌中，PPP3參與成肌細胞分化、成熟肌纖維肥大和響應(yīng)細胞內(nèi)鈣濃度變化的纖維類型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)。有研究表明，PPP3CA基因是小鼠幾乎所有類型骨骼肌的主要催化亞型[10]。此外，PPP3CA基因在天府山羊的股二頭肌、長肌和腹肌中也具有較高水平的表達[11]。迄今為止PPP3CA基因已在人[12]、小鼠[13]、豬[14]和牛[15]等多種動物中克隆并發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白高度保守，關(guān)于黔北麻羊的報道較少。因此，本實驗以黔北麻羊為研究對象，以PPP3CA為候選基因，克隆獲得黔北麻羊PPP3CA基因編碼序列進行生物信息學(xué)分析，運用實時熒光定量PCR 建立黔北麻羊PPP3CA基因的組織表達圖譜，為研究PPP3CA基因的生物信息學(xué)功能機理提供參考作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取貴州省習(xí)水縣富興畜牧業(yè)開發(fā)有限公司提供的6 只健康成年黔北麻羊母羊，羊只屠宰方法參考貴州省地方標準《羊屠宰操作規(guī)程》（DB 22/T 2740-2017），分別采集心、肝、脾、肺、腎、背最長肌6 個組織，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗試劑及儀器 快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T-克隆PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TRIzol＠Reagent 試劑盒為貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司產(chǎn)品；熒光定量試劑q-PCR Mix 為北京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品。電泳儀（DYY-2C型）為北京市六一儀器廠產(chǎn)品；PCR 擴增儀（C1000 TouchTM）、實時熒光定量PCR 儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ）均為美國BIO-RAD 有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 公布的山羊PPP3CA基因序列（登錄號：XM_018049270.1）；利用Primer Premier 5.0 軟件進行克隆、熒光定量引物設(shè)計，以β-actin 為內(nèi)參[16]。設(shè)計后引物交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。引物基本信息見表1。

表1 黔北麻羊PPP3CA 引物信息

1.3.2 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 按照Trizol 法提取組織總RNA，分光光度計測定其濃度及OD 值（OD260/OD280），Hi Fi-Saript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成首鏈cDNA，將產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。

1.3.3 熒光定量PCR 檢測PPP3CA基因的組織表達譜 采用熒光定量PCR 檢測PPP3CA基因在不同組織中的表達情況。擴增體系為10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。qRT-PCR 程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環(huán)；60℃每5 s 增加0.5℃擴增至95℃進行熔解曲線收集，使用SPSS 23.0 軟件進行差異顯著性檢驗。

1.3.4PPP3CA基因CDS 區(qū)的擴增 PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×Es Taq Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1.5 μL，RNase-Free Water 5.5 μL，cDNA 模 板2.0 μL（1 500 ng/μL）。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃終延伸5 min；1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。

1.3.5PPP3CA基因的克隆 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的條帶，取適量純化回收的目的DNA 片段與pMD19-T 克隆載體連接，恒溫水浴16℃連接16 h 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，挑取白色陽性單克隆菌落至LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)（37℃），最后進行菌液PCR 鑒定并送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序[17]。

1.3.6PPP3CA基因的生物信息學(xué)分析 使用Prot Param（http://expasy.org/tools/protparam.h tml）分析StAR 蛋白理化性質(zhì)；使用NPS＠SOPMA 軟件在線分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；使用S WISS-mode（https://swissmodel.expasy.org/）軟件分析、預(yù)測StAR 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；使用ProtScale(http:www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl/）分析親疏水性；使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件進行跨膜區(qū)分析；使用PSORT II Preadict（https://psort.hgc.jp/form2.html）進行亞細胞定位；使用DNASTAR 7.1 軟件中的MegAlign程序進行物種同源性分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1PPP3CA基因克隆引物結(jié)果及PCR 擴增結(jié)果 如圖1 所示，實時熒光定量擴增出約為125 bp 的條帶，CDS區(qū)克隆引物擴增出1 566 bp 的條帶，引物特異性符合實驗要求。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物

2.2PPP3CA基因在黔北麻羊組織表達量分析 由圖2可知，PPP3CA基因在黔北麻羊不同組織中均有不同程度的表達；其中在背最長肌表達量最高，脾臟表達量最低，且兩者之間差異極顯著；背最長肌組織表達量極顯著高于其他組織；肺組織表達量極顯著高于心、肝、脾和腎組織；心、肝、脾和腎之間的組織表達量互不顯著。

圖2 PPP3CA 基因在黔北麻羊組織中表達圖譜

2.3 黔北麻羊PPP3CA基因T 克隆載體的鑒定PPP3CA基因菌液PCR 驗證結(jié)果如圖3 所示，菌液PCR 條帶位置與目的條帶位置一致，CDS 區(qū)片段大小為1 566 bp，可進行下一步實驗。圖4 顯示黔北麻羊PPP3CA基因與NCBI 公布的山羊PPP3CA基因序列吻合度達到100%，無堿基、氨基酸的突變。菌液PCR 與測序驗證證明目的基因pMD19-T-PPP3CA 克隆載體構(gòu)建成功。

圖3 PPP3CA 基因菌液PCR 檢測

圖4 黔北麻羊PPP3CA 部分克隆與NCBI 上傳序列對比結(jié)果

2.4 黔北麻羊PPP3CA基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 理化性質(zhì)分析 經(jīng)ExPASy 在線程序分析可知，黔北麻羊PPP3CA基因的分子式為C2611H4071N703O783S26，分子量約58.67 ku，原子總數(shù)8 194，含有521 個氨基酸，且丙氨酸Leu（L）所占比例最高，為10.0%，色氨酸Trp（W）占比最低，為0.8%。帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為69 個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為57 個，說明該序列帶正電荷。理論等電點PI 為5.58；該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)達48.02，歸為不穩(wěn)定蛋白。

2.4.2 疏水性分析 經(jīng)ProtScale 程序分析黔北麻羊PPP3CA 蛋白的疏水性分析圖譜如圖5 所示，0 為分界點，正值表示疏水性數(shù)值，負值表示親水性數(shù)值，第368 位纈氨酸疏水性最強，分值為1.989，第484 位脯氨酸親水性最強，分值為-2.811，說明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

圖5 PPP3CA 蛋白質(zhì)疏水性圖譜

2.4.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 經(jīng)SOPMA 軟件分析黔北麻羊PPP3CA 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)如圖6 所示，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有4 種結(jié)構(gòu)組成，占比最大的是α-螺旋，為45.68%，其次為無規(guī)則卷曲，占比為37.04%，延伸鏈占比為12.67%，β-折疊占比最小，為4.61%，可知此蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。

圖6 PPP3CA 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

2.4.4 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 經(jīng)SWISS-MODEL 在線分析結(jié)果如圖7 所示，黔北麻羊PPP3CA 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲占據(jù)大部分，與其二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相符。

圖7 PPP3CA 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測

2.4.5 跨膜區(qū)分析 使用TMHMM 在線工具對黔北麻羊PPP3CA 進行跨膜區(qū)分析，結(jié)果如圖8 所示，此蛋白屬于非跨膜蛋白。

圖8 PPP3CA 蛋白的跨膜分析結(jié)果

2.4.6 PPP3CA 蛋白質(zhì)亞細胞定位 使用TargetP 在線軟件對黔北麻羊PPP3CA基因進行亞細胞定位，結(jié)果顯示黔北麻羊PPP3CA 蛋白56.5% 可能定位在細胞質(zhì)中，有56.5%的可能定位在線粒體中，17.4%可能定位在細胞核，液泡和分泌系統(tǒng)的小泡可能性均為4.3%。

2.4.7 PPP3CA 同源性分析及系統(tǒng)進化樹分析 使用DNA star 軟件中的MegAlign 對黔北麻羊PPP3CA 氨基酸編碼序列與人類、綿羊、蝙蝠、雞、大鼠、鯊魚、猩猩、犀牛、海豚、狗10 個物種進行同源性以及MEGA6 系統(tǒng)進化樹結(jié)果分析，結(jié)果如圖9 和圖10 所示。由圖9所知，黔北麻羊PPP3CA 氨基酸序列與人類、綿羊、蝙蝠、雞、大鼠、鯊魚、猩猩、犀牛、海豚、狗的相似性分別達到99.6%、100%、99.4%、98.3%、99.6%、91.5%、99.6%、99.4%、99.4%、99.6%，數(shù)據(jù)表明黔北麻羊PPP3CA 氨基酸序列與這些物種之間相似性很高，其中與綿羊的同源性最高達到100%。由圖10 可知，系統(tǒng)進化樹也證明了黔北麻羊與不同物種間的親緣關(guān)系，與同源性分析的結(jié)果相符合。

圖9 黔北麻羊PPP3CA 同源性分析

圖10 黔北麻羊PPP3CA 系統(tǒng)進化樹

3 討 論

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通過NFAT（活化T 細胞核因子）調(diào)節(jié)基因表達，NFAT 通常位于細胞質(zhì)中，但是在去磷酸化時會轉(zhuǎn)移到細胞核中。NFAT 核易位后，與基因啟動子結(jié)合并調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。因此，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對增加的細胞內(nèi)Ca2+水平作出反應(yīng)，以翻譯該信號以通過NFAT 進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[19]。該途徑在許多器官系統(tǒng)的發(fā)育和功能中發(fā)揮作用，包括免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肌肉骨骼系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)[20]。Myers 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇和神經(jīng)發(fā)育疾病中，PPP3CA基因編碼一種涉及突觸小泡循環(huán)的蛋白質(zhì)，進一步強化了在癲癇中突觸小泡周期失調(diào)的作用。除上述研究外，更多研究是關(guān)于PPP3CA參與骨骼肌生長變化，而關(guān)于黔北麻羊PPP3CA基因的調(diào)節(jié)機制研究甚少。本研究以黔北麻羊組織樣cDNA 為模板擴增的CDS 區(qū)與NCBI 上山羊的氨基酸序列進行對比，沒有發(fā)現(xiàn)突變位點以及氨基酸的改變，說明序列擴增成功。同時，通過軟件分析證明黔北麻羊PPP3CA 編碼蛋白屬于親水性、非跨膜蛋白，并且通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)黔北麻羊PPP3CA與其他物種都有較高的同源性，說明PPP3CA是從同一個祖先進化來的。黔北麻羊PPP3CA與綿羊的同源性最近，親緣關(guān)系最近，達到100%，與鯊魚的同源性關(guān)系較遠，說明黔北麻羊PPP3CA基因符合生物進化進程。使用軟件分析黔北麻羊PPP3CA 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與Wan 等[11]在天府山羊?qū)PP3CA 分析的結(jié)果一致。

同時本實驗發(fā)現(xiàn)，PPP3CA基因在黔北麻羊心、肝、脾、肺、腎、背最6 個組織中有不同程度的表達差異，在背最長肌中表達量最高，在脾中表達量最低。單艷菊等[22]研究了PPP3CA基因在不同品種鴨發(fā)育早期肌肉中的表達，發(fā)現(xiàn)此基因分別在高郵鴨和金頂鴨的胸肌、腿肌中普遍表達水平較高，且在13 胚齡表達量達到最高峰。包艷波[23]研究發(fā)現(xiàn)，PPP3CA基因突變會不同程度影響大骨雞公母雞的肉質(zhì)性狀，尤其在胸肌灰分含量、胸腿肌pH 等方面影響較明顯。彭興等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PPP3CA基因的3 非編碼區(qū)（3 UTR）具有與miR-21結(jié)合的潛在靶位點，豬miR-21 能靶向調(diào)節(jié)PPP3CA基因參與骨骼肌的生長發(fā)育。本實驗也顯示，PPP3CA在山羊不同組織表達且在背最長?。∪饨M織）的表達量最高，與上述結(jié)果[22-24]一致，提示PPP3CA基因也是山羊肌肉纖維生長發(fā)育的重要基因，但關(guān)于PPP3CA基因?qū)ι窖蚣∪馍L的調(diào)控機制還需進一步研究。