HIF-1α參與調(diào)控三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞化療耐藥及體內(nèi)外增殖的機(jī)制研究

王亮，黃琰菁，婁娜娜，吳煥良

目前，乳腺癌作為一種惡性腫瘤嚴(yán)重威脅婦女身心健康，并給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力[1]。在我國，乳腺癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率最高[2]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一種具有高度侵襲性的乳腺癌亞型，占乳腺癌病例的15%～20%，具有較高的腫瘤異質(zhì)性、低分化、快速增殖、早期復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良等特征[3-4]。常規(guī)化學(xué)療法和放射療法是TNBC患者早期和晚期的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，由于缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)[3]，常規(guī)治療效果欠佳，且用于TNBC的化療藥物對癌細(xì)胞的選擇性相對較低，TNBC患者在反復(fù)使用藥物后會產(chǎn)生耐藥性[5]。因此，了解化療耐藥的潛在機(jī)制和潛在分子靶標(biāo)可能有助于 TNBC 的治療。

低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)是細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下表達(dá)并可作出調(diào)控反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，HIF-1α參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) pH、自噬、凋亡、血管生成及自身免疫等過程，并可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控多個靶基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性[6-8]。本研究通過在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)HIF-1α觀察對順鉑敏感性的影響，并探討其對體內(nèi)外增殖的作用及相關(guān)機(jī)制，為三陰性乳腺癌的治療提供新的實驗依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物及細(xì)胞：健康、SPF級BALB/c雌性裸鼠20只，4～6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)批號：SYXK(瓊)2019-0008，動物飼養(yǎng)環(huán)境: 溫度( 22±2) ℃，濕度 60%，12 h 明/暗循環(huán)，自由飲食與飲水；三陰性乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；pEGFP-HIF-1α質(zhì)粒由上海生工生物有限公司設(shè)計構(gòu)建。(2)試藥試劑：青霉素、鏈霉素、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國 Hyclone 公司)，CCK-8試劑盒(美國 Amresco公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光液ECL(南京碧云天生物公司)，HE染色試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，Trizol 試劑盒、SYBR Green qPCR Mix試劑盒(日本Takara 公司)，Lipofectamine 2000試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，RIPA裂解液(北京索萊寶公司)，兔抗Ki-67、兔抗VEGF、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物科技有限公司)。(3)儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Revco公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國 UVP 公司)；MK3 酶標(biāo)儀(美國熱電公司)；FACS-Canto 型流式細(xì)胞儀(美國 BD 公司)；Olympus BX-50 光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 實驗方法 2020年1—12月于海南省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行實驗。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染： 在三陰性乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231中添加含10% 胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁生長，每2～3 d傳代1 次。當(dāng)匯合度達(dá)到80%～90%時，使用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將MDA-MB-231細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個/ml，接種于6孔板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對照組、pEGFP-C1組和pEGFP-HIF-1α組，按照Lipofectamine 2000 說明書操作，空白對照組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，pEGFP-HIF-1α組和pEGFP-C1組分別轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α質(zhì)粒及其pEGFP-C1空載體質(zhì)粒，3組均置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞。

1.2.2 乳腺癌裸鼠模型構(gòu)建：將 4～6 周齡雌性 BALB/c裸鼠20只隨機(jī)數(shù)字表法法分為C1組和HIF-1α組，每組10只。收集轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞，洗滌后用無血清DMEM懸浮細(xì)胞100 μl，HIF-1α組裸鼠注射轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α的MDA-MB-231細(xì)胞，C1組裸鼠注射轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的MDA-MB-231細(xì)胞。在無菌條件下，取細(xì)胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側(cè)乳墊處。1 周后觀察裸鼠成瘤狀況，并定期監(jiān)測腫瘤生長體積，于4周后處死裸鼠，取腫瘤組織用甲醛液固定備用。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 qRT-PCR檢測MDA-MB-231細(xì)胞中 HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA表達(dá)： TRIzol法提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA，Nanodrop測定提取的RNA純度和濃度。按照cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以合成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR 檢測基因mRNA表達(dá)，具體操作參考SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書，以β-actin為內(nèi)參基因，由上海生工生物有限公司合成引物，HIF-1α上游引物: 5’-GTTACAGTATTCCAGCAGA-3’，下游引物: 5’-GTATGTGGGTAGGAGATG-3’；VEGF上游引物: 5’-CGAGCTTCAGGACAATGCTGGTG -3’，下游引物: 5’-GCAGGAAGGTCAACCACTCAC-3’；β-actin上游引物: 5’-CCCTGGCACCCAGCACGCTTC-3’，下游引物: 5’- GCCGATCCACACGGAGTAC-3’。擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性 5 min(1個循環(huán))；95 ℃變性30 s， 55 ℃退火15 s， 72 ℃延伸30 s(40個循環(huán))。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達(dá)水平，

1.3.2 Western-blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞中 HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)：在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford試劑盒檢測上清液蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白樣品通過10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，在5%脫脂奶粉中封閉2 h，滴加特異性一抗HIF-1α(1∶200)、VEGF(1∶200)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃ 下孵育過夜。次日，將印跡用TBST清洗，然后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜后，通過滴加增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過Image-Pro Plus軟件對各蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3.3 CCK-8法檢測 MDA-MB-231細(xì)胞藥物敏感性：將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞以5×104個/ml密度接種于96孔板上，每孔加入100 μl，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，分別加入終濃度為 2、4、8、16、32 μg/ml 順鉑培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后每孔加入 10 μl CCK-8，孵育 2 h 后，采用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度值(OD)，計算藥物半抑制濃度(IC50)。將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞以5×104個/ml密度接種于96孔板上，每孔加入100 μl，培養(yǎng)24 h后加入含7 μg/ml 順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別于0、24、48、72、96 h每孔加入 CCK-8試劑10 μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1 h 后，采用酶標(biāo)儀測定 450 nm處的OD值，計算細(xì)胞生長抑制率。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測MDA-MB-231細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231 細(xì)胞進(jìn)行消化離心，并制成細(xì)胞懸液，使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細(xì)胞，加入1×binding buffer重懸細(xì)胞500 μl，在細(xì)胞懸浮液加入Annexin V-FITC 5 μl，接著加入10 μl的 PI，混勻后室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.5 HE 染色觀察裸鼠腫瘤組織：將甲醛固定好的腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片4 μm厚度；而后進(jìn)行HE染色，蘇木精染色5 min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3 min，用梯度乙醇脫水，二甲苯進(jìn)行透明處理，使用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織切片并采集圖片。

1.3.6 免疫組織化學(xué)方法檢測 Ki-67和VEGF表達(dá)：將制備的裸鼠腫瘤組織石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，采用0.3%過氧化氫(H2O2)處理 30 min，滴加檸檬酸鈉溶液修復(fù)抗原。然后加入山羊血清室溫孵育1 h，將切片與Ki-67(1∶100)、VEGF(1∶100)抗體在4 ℃孵育過夜，次日PBS 液沖洗后，加二抗室溫孵育1 h。滴加 DAB 顯色，自來水洗滌，加蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 3組細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，pEGFP-HIF-1α組細(xì)胞中 HIF-1α mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t/P= 36.027/0.000，25.432/0.000)；pEGFP-C1組細(xì)胞中 HIF-1α mRNA和蛋白相對表達(dá)量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t/P= 0.759/0.106、0.802/0.101)。說明轉(zhuǎn)染成功，見圖 1。

注：A.空白對照組；B.pEGFP-C1組；C.pEGFP-HIF-1α組。與空白對照組比較，aP<0.05

2.2 3組細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，pEGFP-HIF-1α組細(xì)胞中 VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著升高(t/P=24.551/0.000,19.876/000)；pEGFP-C1組細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t/P=0.988/0.071，0.875/0.103)，見圖 2。

注：A.空白對照組；B.pEGFP-C1組；C.pEGFP-HIF-1α組。與空白對照組比較，aP<0.05

2.3 3組細(xì)胞的順鉑 IC50和細(xì)胞生長抑制率比較 與空白對照組比較，pEGFP-C1組 MDA-MB-231細(xì)胞生長抑制率的順鉑IC50差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而pEGFP-HIF-1α組的IC50顯著升高(P<0.05)。順鉑對MDA-MB-231細(xì)胞的生長抑制率隨時間逐漸增加，在培養(yǎng)0、24、48 h內(nèi)順鉑對各組細(xì)胞的生長抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) ；在培養(yǎng)72、96 h pEGFP-HIF-1α組細(xì)胞生長抑制率顯著低于空白對照組(P<0.05)，而pEGFP-C1組細(xì)胞生長抑制率與空白對照組比較差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組MDA-MB-231細(xì)胞順鉑 IC50值與細(xì)胞生長抑制率比較

2.4 3組細(xì)胞凋亡率比較 與空白對照組比較，pEGFP-HIF-1α組細(xì)胞凋亡率顯著降低(t/P=56.437/0.000)，而pEGFP-C1組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t/P=1.560/0.052)，見圖3。

注：A.空白對照組；B.pEGFP-C1組；C.pEGFP-HIF-1α組。與空白對照組比較，aP<0.05

2.5 2組裸鼠腫瘤組織生長比較 在2組裸鼠皮下接種MDA-MB-231細(xì)胞1周后，裸鼠皮下均形成種植瘤，成瘤率為100%；轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α的MDA-MB-231細(xì)胞接種裸鼠 1 周后，種植瘤塊生長較為迅速，在1、2、3、4周時，其腫瘤組織體積顯著大于轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的裸鼠(t/P= 79.987/0.000、120.547/0.000、89.152/0.000、80.984/0.000)，見圖 4。

注：與C1組比較，aP<0.05

2.6 2組裸鼠腫瘤組織病理學(xué)變化比較 HE染色結(jié)果顯示，2組裸鼠所有種植瘤均為癌，且HIF-1α組裸鼠腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞比C1組裸鼠排列更加密集，見圖5。

圖5 2組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞密集比較(HE染色，×100)

2.7 2組裸鼠腫瘤組織Ki-67與VEGF表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，pEGFP-C1組腫瘤中 Ki-67陽性表達(dá)率為(13.56±1.34)%，低于pEGFP-HIF-1α組的(67.23±6.77)%(t/P=83.436/0.000)；VEGF陽性表達(dá)率pEGFP-C1組為(10.22±0.97)%，低于pEGFP-HIF-1α組的(45.87±4.36)%(t/P=67.817/0.000)，見圖6。

圖6 2組裸鼠腫瘤組織中Ki-67與VEGF表達(dá)比較(免疫組化染色，×100)

3 討 論

乳腺癌是全世界女性癌癥相關(guān)死亡的第二大病因，TNBC在年齡超過40歲的女性中更為常見，與其他類型的乳腺癌相比，其復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移率相對較高[4]。

由于缺乏特異性分子靶點和有效的臨床治療手段，以及化療藥物耐藥性的產(chǎn)生，基于以上綜合治療方法尚未有效提高TNBC患者的整體生存率，這使得TNBC治療存在巨大挑戰(zhàn)。低氧水平是許多類型癌癥的常見特征，尤其是諸如TNBC等增生性癌癥[9]。在低氧條件下，腫瘤細(xì)胞激活幾種途徑以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并使癌細(xì)胞出現(xiàn)化療耐藥性。大量研究證實，HIF-1α水平升高與患者預(yù)后差和耐藥性增加之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，HIF-1α通過募集Treg細(xì)胞和抑制腫瘤浸潤性T細(xì)胞來促進(jìn)免疫抑制性微環(huán)境，此外，HIF-1α還通過募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和髓樣抑制細(xì)胞(MDSC)促進(jìn)腫瘤生長[10-11]。這表明HIF-1α可作為一些腫瘤治療新的分子靶點。

本研究成功建立了過表達(dá)HIF-1α的MDA-MB-231細(xì)胞，過表達(dá) HIF-1α的細(xì)胞中順鉑 IC50值明顯升高，而且細(xì)胞凋亡率降低，在順鉑處理下培養(yǎng)72 h和96 h后，過表達(dá) HIF-1α的MDA-MB-231細(xì)胞生長抑制率明顯下降。說明過表達(dá)HIF-1α后減弱了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對順鉑的敏感度。

VEGF是人類癌癥中的主要血管生成因子，血管生成在腫瘤的生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著復(fù)雜的作用[12-14]。多項研究表明，惡性腫瘤患者血清VEGF水平明顯高于良性腫瘤患者，且VEGF水平較高的患者生存時間相對較短[15-17]。也有研究表明，在缺氧條件下和炎性反應(yīng)過程中，VEGF表達(dá)增加[18]。在乳腺癌相關(guān)研究中，抑制VEGF信號通路可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控癌細(xì)胞的生長、存活、抗藥性等[19-21]。本研究結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，注射轉(zhuǎn)染pEGFP-HIF-1α質(zhì)粒MDA-MB-231細(xì)胞的裸鼠腫瘤組織的生長速度較快，且腫瘤組織中VEGF表達(dá)增加，由此說明HIF-1α可能激活VEGF信號通路從而促進(jìn)體內(nèi)外腫瘤的增殖生長。目前，靶向VEGF的抗血管生成療法已成為多種腫瘤的重要治療策略之一。

綜上， HIF-1α過表達(dá)會減弱體外培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞的順鉑敏感性，抑制細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)過表達(dá)HIF-1α可促進(jìn)三陰性乳腺癌腫瘤形成與生長。

(致謝：感謝海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院許佳老師在實驗中提供的幫助)

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王亮：設(shè)計研究方案，論文撰寫；黃琰菁：實施研究過程，分析實驗數(shù)據(jù)；婁娜娜：實施研究過程，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；吳煥良：提出研究思路，論文審核