液質(zhì)聯(lián)用法測定摻有復(fù)原乳的巴氏殺菌乳中的糠氨酸

周鑫，王雪松，谷守國，張淼怡，葛凱，鄭百芹*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）

牛奶等乳制品具有很高的營養(yǎng)價值，在世界各地都有消費[1]。一些乳企使用奶粉溶解在水中制成復(fù)原乳，將其冒充生鮮乳作為原料生產(chǎn)加工成商品奶出售給消費者，但未加復(fù)原乳標(biāo)識，進而損害消費者利益[2]?？钒彼崾窃诿览路磻?yīng)早期階段形成的化合物，而生鮮乳中缺乏糠氨酸[3-4]；濃縮牛奶和奶粉通常是通過熱處理獲得，糠氨酸質(zhì)量分數(shù)的變化受到乳品及生產(chǎn)加工過程中熱處理程度的影響，因而糠氨酸可用于評價乳品的熱加工程度[5]。NY/T 939—2016也將糠氨酸作為巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳鑒定的重要指標(biāo)之一[6]。

檢測液態(tài)奶中糠氨酸的方法較多，其中包括液相色譜法[7-9]、紫外分光光度法[10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-12]、毛細管電泳法[13]等，這些測定方法均能對液態(tài)奶中的糠氨酸進行準確的定量分析。試驗針對不同品牌的奶粉進行溶解，分別以不同比例摻入生鮮乳中，經(jīng)巴氏殺菌，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對殺菌后的乳液進行糠氨酸含量的測定，旨在應(yīng)用該方法提升對于復(fù)原乳摻入生鮮乳的比例下限的辨識度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API 4000 Q trap三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB公司）；Kjeltec8400凱氏定氮儀（丹麥Foss公司）；干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，DHG-9240A）；固相萃取柱：PLS小柱（200 mg/6 mL，Dikma公司）；微孔濾膜（0.22 μm，Dikma公司）。

標(biāo)準品糠氨酸（CAS號19746-33-9，德國Iris公司）；牛奶和奶粉樣品（市售）；甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；其余試劑為國產(chǎn)優(yōu)級純；試驗用水為自制超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

1.2 標(biāo)準溶液配制

準確稱取適量糠氨酸對照品，用3 mol/L鹽酸溶解并定容，配制成50 mg/mL的糠氨酸儲備液，在-18 ℃條件下保存。使用時，根據(jù)需求稀釋成合適濃度。

1.3 樣品處理

稱取不同品牌的奶粉各25 g，分別加入180 mL 45℃超純水，充分溶解，回復(fù)至室溫備用。分別在生鮮乳中摻入0，5%，10%，15%，20%，40%，60%，80%和100%的復(fù)原乳，充分混勻[14-15]。將樣品置于63℃水浴中預(yù)熱30 min，后置于75 ℃水浴中30 s，回復(fù)至室溫備用[16]。

1.4 超高效液相色譜法測定糠氨酸

參照NY/T 939—2016測定糠氨酸。

1.5 液質(zhì)聯(lián)用法測定糠氨酸

準確吸取2.00 mL試樣于耐熱耐壓螺口試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，封閉試管，在110 ℃烘箱中加熱水解16 h。待試管冷卻至室溫后，搖勻水解液并過濾，收集濾液備用。用3 mL甲醇和3 mL水活化、平衡固相萃取柱，取1.0 mL濾液過柱上樣，用2.0 mL水洗脫，收集洗脫液并定容到2.0 mL，取0.5 mL洗脫液，用甲醇稀釋100倍，取適量過膜待上機。

色譜柱，ACQUITY BEH HILIC液相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。流動相A，0.1%甲酸水溶液；流動相B，乙腈。洗脫方式為梯度洗脫，洗脫條件：0~0.5 min，5% A；0.5~1.0 min，5% A升至45% A；1.0~2.2 min，保持45% A；2.2~2.3 min，45%A下降到5% A；2.3~3.5 min，保持5% A。

離子源，電噴霧（ESI+）；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣（GS1）40 psi；輔助氣30 psi（GS2）；碰撞氣（CAD），Medium；源溫550 ℃；噴霧電壓（IS）5 000 V；入口電壓（EP）10 V?？钒彼岜O(jiān)測離子對和碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）參數(shù)見表1。

表1 糠氨酸的選擇離子及碰撞能量

1.6 水解液中蛋白含量測定

參照GB 5009.5—2016測定蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 液質(zhì)聯(lián)用法基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)是樣品中除分析物以外的組分對分析物的分析過程造成的干擾和影響。在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的離子源中，受到基質(zhì)中其他組分競爭電離的影響，目標(biāo)化合物的電離程度往往會受到抑制，相應(yīng)值下降。分別使用溶劑和空白基質(zhì)配制標(biāo)準系列濃度分別上機檢測，利用線性回歸標(biāo)準曲線斜率，評價基質(zhì)效應(yīng)（ME），如式（1）所示。

ME=（slopem/slopes-1）×100% （1）式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；slopem為基質(zhì)標(biāo)標(biāo)準曲線斜率；slopes為溶劑標(biāo)標(biāo)準曲線斜率。計算ME的數(shù)值，根據(jù)其范圍判斷基質(zhì)效應(yīng)的大小程度。ME=-27.5%（見圖1和表2），表明目標(biāo)化合物離子化受到抑制，并屬于中等基質(zhì)效應(yīng)[17]。為消除或減小基質(zhì)效應(yīng)給試驗定量分析帶來的誤差，采用基質(zhì)標(biāo)對牛奶樣品進行定量分析。

圖1 有機溶劑配制糠氨酸標(biāo)準曲線圖

圖2 空白基質(zhì)配制糠氨酸標(biāo)準曲線圖

2.2 液質(zhì)聯(lián)用法與液相法測定糠氨酸結(jié)果比較

采用NY/T 939—2016中超高效液相色譜法和試驗介紹的液質(zhì)聯(lián)用法對糠氨酸定量分析進行比較，2種方法的糠氨酸特征峰色譜圖見圖3和圖4。結(jié)果顯示，糠氨酸在2種檢測方法中均有較好的峰型，這有助于對糠氨酸進行準確定量分析。

圖3 糠氨酸標(biāo)準溶液（2 μg/mL）色譜圖（UPLC）

圖4 糠氨酸標(biāo)準溶液（0.1 μg/mL）MRM色譜圖

選取同一超高溫滅菌乳樣品，分別用超高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法對糠氨酸進行測定分析，比較2種方法的測定結(jié)果，2組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，如表2所示。說明試驗所應(yīng)用的液質(zhì)聯(lián)用法測定糠氨酸是穩(wěn)健、可靠的。

表2 超高效液相法和液質(zhì)聯(lián)用法測定糠氨酸方差分析

2.3 巴氏殺菌乳中的復(fù)原乳測定

選取不同品牌的奶粉N、奶粉A、奶粉L，加水溶解為復(fù)原乳。將得到的3種品牌奶粉的復(fù)原乳按照0，5%，10%，15%，20%，40%，60%，80%和100%的比例添加到生鮮乳中，經(jīng)過巴氏殺菌加熱，使用液質(zhì)聯(lián)用法對處理后的樣品糠氨酸參數(shù)的測定，結(jié)果見圖4和表3。

一般來說，生鮮乳和巴氏殺菌乳中的糠氨酸含量較低，不高于15 mg/100 g蛋白質(zhì)[5]，試驗中3種品牌復(fù)原乳添加0點的巴氏殺菌乳的數(shù)值分別10.08，10.45和9.93 mg/100 g蛋白質(zhì)，與文獻中數(shù)值范圍一致，沒有顯著性差異（p=0.769），說明同一未添加復(fù)原乳的生鮮乳在經(jīng)過巴氏殺菌后，在批次間沒有差異，加熱過程和測定方法穩(wěn)定。

由圖5可知，隨著生鮮乳中復(fù)原乳摻入比例增大，糠氨酸含量呈線性升高，摻入比100%時，即復(fù)原乳經(jīng)巴氏殺菌加熱后的糠氨酸含量最高，3種復(fù)原乳N、A、Y中糠氨酸含量分別為254.84，190.99和188.40 mg/100 g 蛋白質(zhì)，差異主要來源于奶粉本身糠氨酸的含量及奶粉的存儲時間[18]，致使摻入復(fù)原乳N的樣品組形成的擬合曲線斜率要大于另兩組。

圖5 摻入不同比例復(fù)原乳的巴氏殺菌乳糠氨酸含量

在復(fù)原乳N、A、Y每個摻入比設(shè)定點做3個平行重復(fù)試驗，測定糠氨酸含量，并求出其平均值及標(biāo)準差，利用方差分析考察摻入復(fù)原乳比例對糠氨酸測定值的影響程度，如表3所示。通過方差分析研究摻入比例對于復(fù)原乳N、復(fù)原乳A、復(fù)原乳Y共3項的差異性，結(jié)果表明，不同比例樣本對于糠氨酸含量均呈現(xiàn)出顯著性差異（p＜0.05），表明3種品牌的奶粉溶解制成的復(fù)原乳，摻入比例達到5%，即與常規(guī)巴氏殺菌乳有顯著不同，能夠辨別出在加工過程中加入復(fù)原乳。

表3 糠氨酸含量方差分析

牛奶在乳制品工業(yè)中經(jīng)過熱處理，以確保微生物安全和延長保質(zhì)期。不同類型的熱處理可以影響牛奶的感官、理化性質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)[19]。試驗對生鮮乳巴氏殺菌摻入復(fù)原乳的情況進行研究，得到摻入5%復(fù)原乳即與生鮮乳有不同結(jié)果；生鮮乳的超高溫滅菌程度要高于巴氏殺菌，如改變殺菌條件，測定其各摻入比例點的糠氨酸含量，可能得到斜率更低的樣品回歸曲線，使得復(fù)原乳摻入的低比例點相互之間的差異性降低。

接表3

3 結(jié)論

通過對比液質(zhì)聯(lián)用法和超高效液相色譜法測定牛奶中糠氨酸含量，對液質(zhì)聯(lián)用法測定糠氨酸含量的穩(wěn)定性進行確認。生鮮乳經(jīng)由不同品牌奶粉溶解成的復(fù)原乳按照不同比例摻入后進行巴氏殺菌加熱，測定糠氨酸含量。結(jié)果表明，隨著摻入復(fù)原乳比例增大，其糠氨酸含量呈線性增長趨勢；3種復(fù)原乳在摻入5%后，巴氏殺菌乳的糠氨酸含量均有顯著提高。因此應(yīng)用試驗所述的液質(zhì)聯(lián)用法測定巴殺奶中的糠氨酸，最低能辨別到5%的復(fù)原乳添加量，為巴氏殺菌乳中復(fù)原乳的分析提供方法。