SPE/GC-MS測(cè)定3種水產(chǎn)品中的喹哪啶殘留

徐閃浪 ，黃和 *，高平*，陳日檬，曾丹丹，陳營(yíng)壽

1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院（湛江 524088）；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湛江 524088）；3. 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湛江 524088）；4. 廣東海洋大學(xué)分析測(cè)試中心（湛江 524088）；5. 湛江市食品藥品檢驗(yàn)所（湛江 524022）

漁用麻醉劑是通過(guò)抑制活的水產(chǎn)品中樞神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)緩解其應(yīng)激反應(yīng)，降低運(yùn)輸途中的傷亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失目的的藥物，在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的捕捉、運(yùn)輸、取樣、測(cè)量等漁業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究的過(guò)程中[1-2]。喹哪啶（又稱2-甲基喹啉）是一種無(wú)色油狀的喹啉類(lèi)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、染料制備等方面[3]。喹哪啶可用于魚(yú)類(lèi)的短時(shí)間麻醉操作輔助活魚(yú)運(yùn)輸。相比較于其他漁用麻醉劑，喹哪啶快速誘導(dǎo)、恢復(fù)迅速，且價(jià)格低廉，成為新興的漁用麻醉劑之一[4-5]。但喹哪啶具有一定毒性，對(duì)小鼠的LD50為1 230 mg/kg[6]，對(duì)人的皮膚、眼睛、黏膜、上呼吸道具有刺激性作用，此外有試驗(yàn)研究表明喹哪啶對(duì)人體具有慢性致突變作用[7]。倘若其殘留在水產(chǎn)品中，可能對(duì)人體健康造成一定危害。對(duì)于漁用麻醉劑的管理，國(guó)內(nèi)缺乏有效的使用標(biāo)準(zhǔn)[8]，為避免喹哪啶在水產(chǎn)品生產(chǎn)和流通過(guò)程中泛濫使用，對(duì)水產(chǎn)品中喹哪啶麻醉劑殘留進(jìn)行準(zhǔn)確高效的檢測(cè)具有重要的實(shí)際意義。

有關(guān)喹哪啶檢測(cè)方法報(bào)道相對(duì)較少，主要有紫外分光光度（UV）法、氣相色譜（GC）法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[10-11]。UV法靈敏度較低，定性定量不準(zhǔn)，不適合用于痕量分析；GC法雖然操作簡(jiǎn)單，普及性較廣，但容易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾，從而影響目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性與定量；LC-MS/MS法抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高，定性準(zhǔn)確，但儀器昂貴。以南美白對(duì)蝦、石斑魚(yú)和鱖魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，采用氣相色譜-質(zhì)譜法[12-14]結(jié)合固相萃取法[15-16]，建立水產(chǎn)品中喹哪啶麻醉劑殘留的檢測(cè)方法，為水產(chǎn)品中喹哪啶殘留的測(cè)定提供新的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

喹哪啶（CAS號(hào)91-63-4，純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈、正己烷、乙酸乙酯（均為HPLC級(jí)，美國(guó)Honeywell公司）；固相萃取柱：乙二胺-N-丙基柱（PSA，500 mg，6 mL）、氨基柱（NH2，500 mg，6 mL）、弗羅里硅土柱（Florisil，1 000 mg，6 mL）、硅膠柱（Silica，1 000 mg，6 mL，艾杰爾科技有限公司）；苯基柱（Phenyl，500 mg，6 mL，美國(guó)Agilent公司）；石墨化炭黑柱（GCB，500 mg，6 mL，美國(guó)Supelco公司）；均質(zhì)子（1 cm×2 cm，美國(guó)Agilent公司）

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊離子源（EI）（日本SHIMADZU公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；Centrisartg-16C高速冷凍離心機(jī)（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；Vac Elut 20固相萃取裝置（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q IQ7000超純水機(jī)（德國(guó)Merck公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量喹哪啶標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.01 mg）用乙酸乙酯溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用乙酸乙酯稀釋成質(zhì)量濃度10，20，50，100，200和500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

將石斑魚(yú)、鱖魚(yú)、南美白對(duì)蝦等樣品取肌肉部分，用勻漿機(jī)絞碎混勻，于-18 ℃以下條件冷凍保存?zhèn)溆?，使用時(shí)取出自然解凍 。

提?。悍Q取2 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL超純水和1顆均質(zhì)子，旋渦振蕩1 min，加入10 mL乙腈，旋渦振蕩5 min后超聲提取10 min，加入2 g氯化鈉（NaCl）手搖1 min，以5 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另1支50 mL離心管中；加入10 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并乙腈提取液，加入2 g無(wú)水硫酸鎂（MgSO4），劇烈振搖1 min，以5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL雞心瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，3 mL正己烷復(fù)溶待凈化。

凈化：依次使用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷活化Silica固相萃取柱，將復(fù)溶液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用3 mL正己烷潤(rùn)洗雞心瓶，全部倒入固相萃取柱中，依靠重力自然流出。用5 mL正己烷淋洗固相萃取柱，棄掉全部流出液，用5 mL乙酸乙酯洗脫并收集，40 ℃水浴氮吹至體積小于2 mL，再用乙酸乙酯定容至2 mL供GC-MS分析。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1) 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃。升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至280 ℃保持17 min。載氣，高純氦氣（純度≥99.999%）；總流量35 mL/min；恒壓模式90 kPa；進(jìn)樣模式，不分流模式；進(jìn)樣量1 μL。

2) 質(zhì)譜條件

離子源溫度230 ℃；接口溫度260 ℃；電離方式，電子轟擊源（EI）；電離能量70 eV；溶劑延遲5 min；檢測(cè)方式，選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式。在上述條件下喹哪啶標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見(jiàn)圖1，喹哪啶保留時(shí)間、定量和定性離子及豐度比見(jiàn)表1。

表1 喹哪啶的保留時(shí)間以及定量、定性離子

圖1 喹哪啶標(biāo)準(zhǔn)溶液SIM模式下總離子流圖（50 μg/L）

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察SH-RTx-5MS、DB-5MS、DB-17MS這3種色譜柱對(duì)喹哪啶的分離效果（見(jiàn)圖2）。采用SHRTx-5MS色譜柱時(shí)，目標(biāo)物出峰時(shí)間較早，噪音較大，基線不穩(wěn)，峰形較差，拖尾嚴(yán)重；采用DB-5MS色譜柱時(shí)，出峰時(shí)間稍晚，雖基線和峰形均有所改善，但仍有拖尾現(xiàn)象；采用DB-17MS色譜柱時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間較理想，分離效果好，基線平穩(wěn)，峰形尖銳。因此，選擇DB-17MS色譜柱為分析柱。

圖2 不同色譜柱對(duì)喹哪啶分離效果的影響

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)選擇乙腈、乙腈+乙酸乙酯（1∶1，V/V）、正己烷+丙酮（3∶1，V/V）、正己烷4種有機(jī)溶劑作為提取溶劑，考察其對(duì)水產(chǎn)品中喹哪啶的提取效果。稱取2 g水產(chǎn)品（石斑魚(yú)）空白樣品于50 mL離心管中，添加250 μg/kg喹哪啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別使用4種溶劑進(jìn)行提取，提取液定容至20 mL，上機(jī)測(cè)定（總離子流見(jiàn)圖3）并計(jì)算回收率，每種提取溶劑設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

圖3 不同提取溶劑對(duì)喹哪啶的提取效果

結(jié)果顯示，正己烷+丙酮（3∶1，V/V）和正己烷作為提取溶劑時(shí)，雖回收率均≥120%，但雜質(zhì)較多，后期凈化難度大，對(duì)儀器和色譜柱影響和傷害也較大。乙腈和乙腈+乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為提取溶劑時(shí)，回收率為95%~100%，提取效果無(wú)明顯差別，但乙腈+乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為提取溶劑時(shí)，回收率不穩(wěn)定，因此試驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。在提取時(shí)加入均質(zhì)子輔助，振蕩過(guò)程中進(jìn)一步混勻樣品，增大提取效果。同時(shí)在提取溶液中加入NaCl促進(jìn)水相和有機(jī)相分離，不僅減輕后續(xù)凈化過(guò)程的除水壓力，還增大待測(cè)組分在乙腈相中的分配比，提取效果更好。

2.2.2 固相萃取柱的選擇

水產(chǎn)品樣品基質(zhì)較復(fù)雜，提取液需經(jīng)凈化處理才可上機(jī)測(cè)定。固相萃取法是試驗(yàn)室最為常用的凈化方式，其操作簡(jiǎn)單，凈化效果較好[17]。試驗(yàn)稱取2 g水產(chǎn)品（石斑魚(yú)）空白樣品中，加入50 μg/kg喹哪啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.2進(jìn)行提取后，分別擬采用NH2柱、Florisil柱、Silica柱、PSA柱、Phenyl柱、GCB柱[18-19]6種固相萃取柱凈化喹哪啶提取液，上機(jī)測(cè)定并計(jì)算和比較加標(biāo)回收率。每種固相萃取柱設(shè)置3組平行試驗(yàn)，不同固相萃取柱凈化后的回收率的比較見(jiàn)圖4。

圖4 不同類(lèi)型固相萃取柱對(duì)喹哪啶加標(biāo)回收率的影響

6種不同固相萃取柱的回收率差異較大，其中NH2柱、Florisil柱、PSA柱、Phenyl柱4種柱子凈化效果略差，回收率均≤70%；GCB柱和Silica柱2種柱子凈化效果較好，回收率均≥88%。但GCB柱凈化時(shí)用乙腈-甲苯混合洗脫，甲苯毒性大，氮吹時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮試驗(yàn)成本、試劑毒性、試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)等多方面因素，故最終選擇Silica柱作為凈化固相萃取柱。

2.2.3 洗脫溶劑體積的選擇

考察乙酸乙酯作為洗脫溶劑時(shí)，洗脫溶劑體積對(duì)喹哪啶回收率的影響。選擇3，4，5，6，7和8 mL的6組不同洗脫溶劑體積，每組進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，洗脫溶劑體積3 mL時(shí)，回收率為55%~65%；隨著洗脫溶劑體積增加，回收率有所提高，洗脫溶劑體積5 mL時(shí)，回收率為88%~95%；但洗脫溶劑體積＞5 mL時(shí)，回收率沒(méi)有明顯增加。因此，考慮到節(jié)約成本和避免水浴氮吹時(shí)間太長(zhǎng)，試驗(yàn)選擇5 mL乙酸乙酯作為洗脫溶劑。

2.3 方法線性范圍、檢出限和定量限

將1.2.1配制的質(zhì)量濃度分別為10，20，50，100，200和500 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.3條件進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，以峰的面積（y）為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程為y=745.54x+3 324.08。結(jié)果表明，喹哪啶在10~500 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20]，以3倍信噪比（S/N≥3）計(jì)算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）計(jì)算方法定量限（LOQ），同時(shí)結(jié)合儀器實(shí)際響應(yīng)情況，計(jì)算得喹哪啶的方法檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

空白南美白對(duì)蝦、石斑魚(yú)、鱖魚(yú)肌肉樣品中分別添加20，40和200 μg/kg喹哪啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行同時(shí)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照，按照1.2.2進(jìn)行提取、凈化、上機(jī)測(cè)定，計(jì)算喹哪啶的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，喹哪啶平均加標(biāo)回收率為80.0%~98.2%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為3.3%~11.5%，表明試驗(yàn)方法回收率較好，重復(fù)性高，符合殘留分析要求[21]。

表2 加標(biāo)樣品的回收率和精密度（n=6）

空白石斑魚(yú)樣品和石斑魚(yú)加標(biāo)樣品SIM模式下總離子流圖見(jiàn)圖5。

圖5 空白和加標(biāo)石斑魚(yú)在SIM模式下總離子流圖

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用建立的方法對(duì)湛江某水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的10份水產(chǎn)品樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所有樣品均未檢出喹哪啶。

3 結(jié)論

建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定水產(chǎn)品中喹哪啶麻醉劑殘留的檢測(cè)方法，其檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg，平均回收率為80.0%~98.2%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%~11.5%。該方法簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè)成本低，回收率高，重現(xiàn)性好，適合用于水產(chǎn)品中喹哪啶麻醉劑殘留的測(cè)定。