硫化物生物抑制劑體系篩選及應用*

鄧舒元，王 博，孫珊珊，白拉貝，佘躍惠，張 凡

（1.中國地質大學（北京）能源學院，北京 100083；2.長江大學石油工程學院，湖北武漢 430100）

0 前言

在油田生產過程中，伴隨著大量硫化物的產生。然而硫化物的危害極大，不僅可以腐蝕金屬設備，還可以對油田生產和現(xiàn)場施工人員的安全造成很大的影響，油田中硫化物含量增加的主要原因是硫酸鹽還原菌（SRB）利用水中的硫酸根離子還原成了H2S。SRB是一類形態(tài)各異、營養(yǎng)類型多樣、在厭氧或微氧環(huán)境中以硫酸鹽或者其他氧化態(tài)硫化物作為電子受體來氧化有機物質，并產生硫化氫（H2S）的革蘭氏陽性或陰性細菌或古菌［1］。在1926年，SRB首次從油藏中分離出來［2］，硫酸鹽還原被廣泛認為是油藏本源微生物進行的主要代謝過程之一［3］。在原油開發(fā)開采過程中發(fā)生的厭氧腐蝕中，SRB是最具破壞性的微生物，造成石油行業(yè)巨大的經濟損失［4-5］。在二次采油過程中，注入水中所含的硫酸鹽會增加儲層或地面設施中SRB的活性，SRB產H2S現(xiàn)象變得更加普遍和嚴重［5］。

生物競爭法是通過激活硝酸鹽還原菌（NRB）來抑制SRB 的活性，從而控制H2S 的產生［6-7］，相比其他方法，這種方法更具優(yōu)勢，因而越來越受到人們的關注。一方面，硝酸鹽成本低，毒性小且可以迅速擴散到儲層中［5，8-9］；另一方面，激活的NRB 菌群有利于提高原油采收率［10］。NRB 通過競爭SRB的電子供體［11］，使硫化物被化學自養(yǎng)型細菌如硫桿菌（Thiobacillus）或硫微螺菌（Thiomicrospira）氧化，這些微生物將硝酸鹽作為電子受體［12-13］，因而SRB的活性被硝酸鹽還原的中間產物亞硝酸鹽和三價氮抑制［14］。NRB 和SRB 之間爭奪電子供體的競爭機制是通過硝酸鹽來控制H2S產生，因為NRB在基質利用和能量消耗上優(yōu)先于SRB。大多數(shù)NRB 為兼性厭氧細菌，在無氧條件下將硝酸鹽作為電子受體并還原為N2。NRB 的激活能從減少數(shù)量和降低活性兩個方面同時對SRB進行抑制，減少硫化物的產生15］。

在實驗室中模擬地層中的溫度和厭氧環(huán)境，以吐哈油田丘陵站污水為研究對象富集培養(yǎng)，分別加入不同濃度的生物抑制劑體系，根據SO42-消耗量優(yōu)選最優(yōu)體系。將最優(yōu)的生物劑體系用于礦場試驗，監(jiān)測不同階段的SRB、NRB、硫化物和懸浮物含量。通過分析加生物抑制劑前后微生物菌群的變化，得出生物抑制劑抑制油田污水中硫化物的機理。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化銨、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鈉、乳酸鈉、硝酸鈉、胺類化學藥劑、咪唑類化學藥劑、次氮基三乙酸、六水合氯化鐵、四水合氯化錳、六水合氯化鈷、二水合氯化鈣、氯化鋅、二水合氯化銅、硼酸、二水合鉬酸鈉、六水合氯化鎳、生物素、葉酸、鹽酸吡哆醇、二水鹽酸硫胺、核黃素、煙酸、D-泛酸鈣、維生素B12、對氨基苯甲酸、硫辛酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；刃天青，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；酵母粉，武漢生物科技有限公司；土壤DNA 提取試劑盒，Qbiogen Carlsbad CA，USA。

厭氧培養(yǎng)瓶，海門市華凱實驗器材有限公司；SRB-HX-7 細菌測試瓶，北京華興化學試劑廠；LS-B50L 型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；pHs-2F型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；VS-840K-U 型潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；DYY-bc 型電泳儀，北京市六一儀器廠；EDC-810型PCR擴增儀，示勝創(chuàng)新生物科技有限公司；凝膠成像分析儀，美國新英格蘭生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物抑制劑優(yōu)選實驗

配制SRB、NRB，SRB 和NRB 混合培養(yǎng)基各1 L，在SRB 和混合培養(yǎng)基組中加入鐵釘作除氧滅菌處理，分裝到250 mL 厭氧瓶中，接入100 mL 培養(yǎng)基，接入5%的丘陵水樣在37 ℃下進行硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌以及混合菌培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后觀察培養(yǎng)基顏色的變化及有無沉淀的產生，在SRB 和NRB 混合培養(yǎng)基中加入0.3%的硝酸鈉再培養(yǎng)4 d，觀察培養(yǎng)基的顏色變化，并測定SRB、NRB 和硫化物的數(shù)量，每個樣做兩組平行實驗。

優(yōu)選最佳的生物抑制劑濃度：首先在實驗室中評價只加JHB對油田污水中硫化物抑制的效果，配制1 號富集培養(yǎng)基，接入5%的丘陵污水，向培養(yǎng)基中分別加入0、50、100、150和200 mg/L JHB，根據不同時間段硫酸鹽的轉化率優(yōu)選最佳JHB濃度。

優(yōu)選最優(yōu)的生物抑制劑體系：配制1 號富集培養(yǎng)基，接入5%的丘陵污水，加入最優(yōu)濃度的JHB，再分別加入40、80、160 和240 mg/L 硝酸鈉，根據硫酸鹽濃度確定最優(yōu)的硝酸鈉濃度。最優(yōu)生物抑制劑體系為最佳的JHB 濃度和硝酸鈉濃度時的復配體系。

SRB富集培養(yǎng)基：在1 L的去離子水中加入5 g氯化鈉、1.8 g 氯化鎂、0.02 g 氯化鈣、0.3 g 氯化銨、0.2 g磷酸氫二鉀、0.5 g氯化鉀、4 g硫酸鈉、1 g乳酸鈉、1 g酵母粉、1 mL微量元素、1mL 0.1%刃天青和2 mL復合維生素溶液而得。

NRB富集培養(yǎng)基：在1 L的去離子水中加入5 g氯化鈉、1.8 g 氯化鎂、0.02 g 氯化鈣、0.3 g 氯化銨、0.2 g磷酸氫二鉀、0.5 g氯化鉀、3 g硝酸鈉、1 g乳酸鈉、1 g酵母粉，1 mL微量元素、1 mL 0.1%刃天青和2 mL復合維生素溶液而得。

NRB、SRB混合培養(yǎng)基：在1 L的去離子水中加入5 g氯化鈉、1.8 g氯化鎂、0.02 g氯化鈣、0.3 g氯化銨、0.2 g 磷酸氫二鉀、0.5 g 氯化鉀、4 g 硫酸銨、3 g硝酸鈉、1 g 乳酸鈉、1 g 酵母提取物、1 mL 微量元素、1 mL 0.1%刃天青和2 mL復合維生素溶液而得。

1 號富集培養(yǎng)基：在1 L 的去離子水中加入5 g氯化鈉、1.8 g 氯化鎂、0.02 g 氯化鈣、0.3 g 氯化銨、0.2 g 磷酸氫二鉀、0.5 g 氯化鉀、1.5 g 硫酸鈉、1 g 乳酸鈉、1 g酵母粉、1 mL微量元素、1 mL 0.1%刃天青和2 mL復合維生素溶液而得。

微量元素溶液：在1 L去離子水中加入3 g次氮基三乙酸、1.35 g 六水合氯化鐵、0.1 g 四水合氯化錳、0.024 g六水合氯化鈷、0.1 g二水合氯化鈣、0.1 g氯化鋅、0.025 g 二水合氯化銅、0.01 g 硼酸、0.024 g二水合鉬酸鈉、0.12 g六水合氯化鎳而得。

維生素溶液：在1 L 去離子水中加入2 mg 生物素、2 mg 葉酸、10 mg 鹽酸吡哆醇、5 g 二水鹽酸硫胺、5 mg 核黃素、5 mg 煙酸、5 mg D-泛酸鈣、0.1 mg 維生素B12、5 mg 對氨基苯甲酸、5 mg 硫辛酸而得。

1.2.2 NRB、SRB菌數(shù)和硫化物和懸浮物含量的測定

采用SRB-HX-7 細菌測試瓶（北京華興化學試劑廠），使用絕跡稀釋法（MPN法）測定水樣中SRB、NRB 菌數(shù)。計數(shù)培養(yǎng)基由在1 L 去離子水中加入5 g氯化鈉、1.8 g氯化鎂、0.02 g氯化鈣、0.3 g氯化銨、0.2 g K2HPO4、0.5 g氯化鉀、3 g硝酸鈉、1 g乳酸鈉和1 g 酵母粉所得。采用GC-SSD 方法測定水樣中的硫化物含量。根據中國石油天然氣行業(yè)標準SY/T 5329—94《碎屑巖油藏注水水質推薦指標及分析方法》，測定水樣中懸浮物含量。

1.2.3 生物抑制劑現(xiàn)場應用評價

將最優(yōu)的生物抑制劑體系注入現(xiàn)場水中，并連續(xù)取樣7 d，測定NRB 菌數(shù)、SRB 菌數(shù)、pH 值、硫化物含量和懸浮物含量，根據水質排放指標評價生物抑制劑的效果。

1.2.4 微生物菌群變化分析

DNA提取和PCR擴增：將加入生物抑制劑前后的污水樣品以12000 r/min 的轉速離心8 min 后收集樣品中的細胞，通過土壤DNA 提取試劑盒提取樣品中的DNA，PCR 擴增選用引物對27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 533R（05'TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'）擴增細菌16S rRNA基因V1-V3區(qū)。

克隆驗證PCR 擴增：將擴增產物PCR 用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行電泳分離，通過天根DNA凝膠回收試劑盒進行純化。根據載體說明書將割膠回收后的16Sr DNA 片段與T-easy-T3 vector（全式金，北京）進行連接。挑取少量菌體作為模板，進行克隆驗證PCR 擴增，所用的引物為T7（5'-ggCCgCgggAATTCgATT-3'）和 SP6（5'-gCgAATTCACTAgTgATT-3'）。

微生物菌群的鑒定：根據克隆文庫中的OTU種類和每個OTU 的克隆數(shù)目，計算克隆文庫的庫容值，通過Analytic Rarefaction 1.3（http：//www.uga.edu/strata/software/Software.htmL）軟件作Rarefaction 曲線。從每個OUT 種類中挑一個代表克隆進行測序（由北京美吉測序公司測序）。通過DNAMAN version 5.2.2.0 軟件對序列進行處理，處理后的序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）數(shù)據庫中進行BLAST比對分析，尋找最相似的已知序列及最相似的已知分類地位的序列從而鑒定微生物群落的組成。

2 結果與討論

2.1 丘陵站污水本源菌群的鑒定

根據分子克隆建庫方法的測序結果分析吐哈油田丘陵站污水本源菌群如表1 所示，其中優(yōu)勢菌為嗜熱脫硫微球菌（Desulfomicrobium thermophi?lum，占比43.34%）、硝基還原鈣二鐵弧菌（Calditerri?vibrio nitroreducens，占比21.11%）、未培養(yǎng)擬桿菌（Uncultured Bacteroidetes bacterium，占比8.89%）和產琥珀酸油桿菌（Petrobacter succinatimandens占比為7.78%）。

表1 吐哈油田丘陵站污水本源微生物群落組成

丘陵污水站污水中SRB菌群占絕對優(yōu)勢，主要為嗜熱脫硫微球菌（Desulfomicrobium thermophi?lum），該菌為中等嗜熱SRB，能利用廣泛的電子供體，如H2、乳酸、丙酮酸、乙醇、蘋果酸、富馬酸酯、正丙醇等，在硫酸鹽存在的環(huán)境下進行硫酸鹽還原的代謝活動［16］。另一方面，丘陵污水站污水中有一定量的NRB菌群，其中硝基還原鈣二鐵弧菌（Calditer?rivibrio nitroreducens）為中等嗜熱NRB，能利用乙酸鹽、丙酮酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酵母提取物和酪蛋白氨基酸作為電子供體，硝酸鹽是唯一的電子受體［17］。產琥珀酸油桿菌（Petrobacter succi?natimandens）也為中等嗜熱NRB，在氧氣存在下可以富馬酸鹽、丙酮酸鹽、琥珀酸鹽、甲酸鹽、乙醇和酵母提取物或硝酸鹽為末端電子受體，將硝酸鹽還原為一氧化二氮［18］。丘陵站污水中表現(xiàn)高的SRB菌群數(shù)量以及活性，是造成該油田硫化氫含量高的主要因素。同時丘陵站污水中存在一定數(shù)量的NRB，使得丘陵站污水運用生物競爭法抑制SRB可行。

2.2 硫化物生物抑制劑體系的篩選

丘陵站污水呈棕黑色，SRB 數(shù)量為104個/mL，NRB 數(shù)量為102個/mL，硫酸根離子濃度為150 mg/L，硝酸根離子濃度為3～18 mg/L，碳酸根離子濃度為2～30 mg/L，低分子有機酸總濃度為12 mg/L，丘陵站污水能為NRB 和SRB 的生長提供基本的營養(yǎng)供應。

SRB、NRB、NRB 和SRB 混合培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后，SRB組出現(xiàn)黑色沉淀，且SRB細菌數(shù)達到104個/mL 以上?；旌吓囵B(yǎng)組的培養(yǎng)液中也有黑色沉淀，且硫化物濃度達到150 mg/L。在混合培養(yǎng)組中再添加0.3%NaNO3，培養(yǎng)4 d后黑色沉淀無明顯變化，說明SRB占絕對優(yōu)勢，硫化物濃度為65 mg/L，因此還需要加入一定的抑制劑來抑制SRB。目前有報道指出將硝酸鹽與其它抑制劑復配能快速有效抑制硫化物的產生［19］。Hitzman 等已經報道了硝酸鹽、亞硝酸鹽和鉬酸鹽在SRB 中的協(xié)同抑制作用［20］。Reinsel 等在裝有油田污水的填砂模擬柱中連續(xù)添加亞硝酸鹽，使亞硝酸鹽濃度保持在0.71～0.86mmol/L之間，完全抑制了H2S的產生［14］。Nemati等通過研究發(fā)現(xiàn)，初期時添加0.1 mmol/L亞硝酸鹽或0.024 mmol/L 鉬酸鹽可以阻止SRB（Lac6）菌株產生H2S，隨著SRB的快速增長，為了抑制H2S的產生，需要使用0.25 mmol/L的亞硝酸鹽或0.095 mmol/L的鉬酸鹽抑制［19］。

JHB 為胺類和咪唑類化學藥劑的復配體系，可以和硝酸鹽協(xié)同抑制油藏中的硫化物。本文主要為了探究生物抑制劑JHB 和硝酸鹽對SRB 的協(xié)同生物競爭抑制效果，通過測定濃度變化，確定具有最佳抑制效果的JHB/硝酸鈉體系?；诮洕h(huán)保、抑制機理的綜合因素考慮，雖然JHB 有一定的抑制效果，但是在實際應用中單獨使用JHB會使腐蝕微生物的耐藥性增強，要不定期加大JHB注入濃度。SRB主要是利用硫酸根離子還原H2S引起油田腐蝕的，加入JHB后，前12 h每隔4 h測一次溶液中硫酸根離子的含量，12 h 后每隔12 h 測一次硫酸根離子的含量。根據各個時間段硫酸根離子的含量算出轉化率，即（150 mg/L-不同時間段硫酸根離子濃度）/150 mg/L，硫酸根離子轉化率越低，JHB抑制效果越好。在不同濃度JHB抑制作用下，硫酸鹽的轉化率隨培養(yǎng)時間的變化見表2。與空白實驗相比，加入抑制劑JHB后，SRB的活性得到明顯抑制，考慮經濟因素，JHB 和硝酸鈉協(xié)同抑制時的最佳JHB加量確定為80 mg/L。

表2 不同JHB濃度下硫酸鹽轉化率隨培養(yǎng)時間的變化

JHB和硝酸鹽對SRB活性具有協(xié)同抑制作用，盡管抑制機理尚不清楚，但同時加入JHB和硝酸鈉要比單獨加入JHB或者硝酸鹽的抑制效果好［6］。固定JHB 濃度為80 mg/L，不同NaNO3濃度（分別為40、80、160 和240 mg/L）下濃度隨培養(yǎng)時間的變化見圖1。

圖1 固定JHB濃度80 mg/L，不同硝酸鈉濃度下濃度隨培養(yǎng)時間的變化

2.3 現(xiàn)場應用效果

在現(xiàn)場應用最優(yōu)的生物抑制劑體系（JHB 60 mg/L+硝酸鈉200 mg/L），并連續(xù)取樣7 d 測定處理前后懸浮物含量、NRB 菌數(shù)、SRB 菌數(shù)、pH 值和硫化物含量，結果見表3。結果表明，礦場試驗過程中NRB 被有效激活，菌數(shù)最高達到106個/mL 以上，SRB菌數(shù)低于102個/mL，硫化物含量抑制在1 mg/L以下，滿足水質排放指標要求（SRB低于102個/mL，硫化物含量低于3 mg/L）。本次試驗證實在礦場條件下硫化物生物抑制劑體系能有效抑制油田污水中硫化物的產生。

表3 礦場試驗階段水質主要指標檢測結果

2.4 現(xiàn)場應用微生物抑制劑后的微生物菌群變化

將生物抑制劑用于丘陵占污水抑制硫化物現(xiàn)場試驗后，污水中微生物群落組成見表4。其中，優(yōu)勢菌為假單胞菌（Pseudomonas balearica，占比46.68%）和施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri，占比38.89%）。假單胞菌（Pseudomonas balearica）和施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）均為反硝化菌［19-22］，他們主要以廢水中的易生化有機物為電子供體和能量來源，在無氧或低氧條件下進行反硝化作用，將廢水中的含氮污染物（NO3-和NO2—）還原成氣態(tài)氮（主要為N2，并伴有少量的NO 和N2O）［22］。現(xiàn)場應用生物抑制劑后的微生物優(yōu)勢菌群由嗜熱脫硫微球菌（Desulfomicrobium thermophilum）轉變?yōu)榧賳伟≒seudomonas balearica）和施氏假單胞菌（Pseudo?monas stutzeri）。

表4 現(xiàn)場應用微生物抑制劑后的微生物群落組成

3 結論

經過實驗室富集培養(yǎng)篩選出最優(yōu)的生物抑制劑體系為：40～80 mg/L JHB+160～240 mg/L 硝酸鈉。在現(xiàn)場試驗中運用60 mg/L JHB+200 mg/L 硝酸鈉的生物抑制劑體系處理污水后，SRB菌數(shù)低于102個/mL，硫化物含量低于1 mg/L，懸浮物含量降至30 mg/L 以下，達到水質排放的要求。加生物抑制體系后微生物優(yōu)勢菌群由SRB-嗜熱脫硫微球菌（Desulfomicrobium thermophilum，占比43.34%）轉變?yōu)榧賳伟≒seudomonas balearica，占比46.68%）和施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri，占比38.89%）。硫化物生物抑制劑體系通過抑制SRB 的活性來抑制丘陵站污水中硫化物產生，為抑制油田中硫化物的產生提供了一種可行性的方法。。