小管福壽螺SNP標記開發(fā)及其在物種鑒定中的應(yīng)用

林 英,肖 麒,林友福,李雪霞,殷文莉,李 宏,陳 煉

(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210023) (2.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院,江蘇 南京 210037)

福壽螺屬(Pomacea)隸屬于腹足綱(Gastropoda)新進腹足目(Caeogastropoda)瓶螺科(Ampullariidae),是原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域的一類大型淡水螺[1]. 因人類有意引種或無意傳播,福壽螺屬多個物種現(xiàn)已入侵到亞洲、北美、歐洲及大洋洲的許多國家和地區(qū),成為嚴重的入侵性有害生物[2]. 小管福壽螺(Pomaceacanaliculata)和斑點福壽螺(P.maculata)是福壽螺屬中常見且入侵性最強的兩種物種[3]. 其中,小管福壽螺被國際自然保護聯(lián)盟(IUCN)列為全球100種惡性外來物種之一[4]. 小管福壽螺自20世紀80年代初作為食物引入到我國以來,迅速定殖并擴展到很多地區(qū),成為我國長江以南大部分省區(qū)的嚴重農(nóng)業(yè)有害生物,并且呈現(xiàn)由南向北擴散的趨勢[5].

福壽螺屬傳統(tǒng)的分類方法主要依靠形態(tài)學特征[6]. 然而,福壽螺屬物種形態(tài)相似,且具有較高的形態(tài)可塑性,難以實現(xiàn)物種的準確鑒定和鑒別[7]. 過去認為,引入中國的福壽螺屬生物僅有小管福壽螺,Lv等[8]利用線粒體COI基因序列對我國54個福壽螺地理種群進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,中國大陸地區(qū)的福壽螺種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜,可能有多種來源和擴散模式,并且發(fā)現(xiàn)入侵中國的福壽螺除了有小管福壽螺和斑點福壽螺這兩種之外,還存在一個中國特有的隱存種團(Cryptic groups). 近期研究基于線粒體COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)生分析和形態(tài)學特征確定其為中國分布的第三種入侵性福壽螺(P.occultanov. sp.)[9].

雖然福壽螺種間形態(tài)相似,但其生物學、生態(tài)學特征以及原產(chǎn)地的地理分布不同,入侵能力和擴散趨勢等方面存在差異[3]. 利用有效的鑒定方式對福壽螺進行準確的種類鑒別,對于控制其快速擴散、制定有效的防治措施具有重要意義. 現(xiàn)有研究大多利用基于線粒體COI基因和核基因EF1α的序列分析[10]或多重PCR擴增技術(shù)[11-12]來鑒別福壽螺種類. 然而,長片段擴增對于樣本的質(zhì)量要求較高,并且鑒定成本高. 此外,遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)是影響入侵種定殖的重要因素,利用分子標記進行種群遺傳學研究有利于開展入侵物種的控制與管理[13]. SNP標記作為第三代分子遺傳標記,具有數(shù)量豐富、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、二等位性、分析成本較低且DNA降解耐受性較高等特點[14-15],近年來在群體遺傳分析及動物個體、品種鑒定方面的研究應(yīng)用較多. 本研究基于小管福壽螺和斑點福壽螺全基因組重測序數(shù)據(jù),借助Sanger測序法驗證開發(fā)多態(tài)性SNP位點,為后續(xù)群體遺傳學研究的開展提供了工具. 同時,針對多態(tài)性位點根據(jù)其在小管福壽螺和斑點福壽螺間的遺傳分化指數(shù)(Fst)及基因頻率信息,進一步篩選在兩物種中存在明顯區(qū)別的SNP位點,為兩種福壽螺提供高效、便捷、準確的鑒定方法.

A-B:小管福壽螺;C-D:斑點福壽螺圖1 福壽螺的螺殼形態(tài)Fig.1 Shell morphology of Pomacea spp.

1 材料與方法

1.1 樣品采集及物種鑒定

2019年3月至7月共采集來自重慶(N=10)、四川成都(N=5)、浙江麗水(N=30)、江蘇蘇州(N=3)的48只野生福壽螺,螺長范圍為30 mm～45 mm.

剪取福壽螺腹足肌提取基因組總DNA,DNA提取使用百奧萊博科技(北京)有限公司柱式軟體動物DNA提取試劑盒(BTN101111),方法參照試劑盒的使用說明. 利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性.

由于福壽螺屬物種如小管福壽螺和斑點福壽螺外部形態(tài)相似,難以區(qū)分,在螺殼形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上(圖1)結(jié)合線粒體COI基因序列進行物種鑒定[3,9]. 結(jié)果表明,本研究樣本中包括30只小管福壽螺,均來自浙江麗水和18只斑點福壽螺,來自重慶、四川成都和江蘇蘇州.

1.2 SNP位點篩選

本研究基于課題組前期已獲得的75只小管福壽螺和23只斑點福壽螺全基因組重測序數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未發(fā)表),將原始數(shù)據(jù)(raw data)去除接頭序列和數(shù)據(jù)質(zhì)控后,利用BWA軟件[16],將有效測序數(shù)據(jù)(clean data)比對小管福壽螺參考基因組(ASM307304v1)[17],比對結(jié)果經(jīng)Picard(http://broadinstitute.github.io/picard/)去除重復(fù). 使用GATK 4.0軟件[18]進行SNP檢測分析,篩選測序深度不低于7X、覆蓋所有群體95%以上個體、次等位基因頻率(MAF)不低于0.05的SNP位點用于SNP標記開發(fā). 使用ANNOVAR軟件[19]對SNP進行注釋.

基于上述成功開發(fā)的多態(tài)性SNP位點,利用VCFtools(v0.1.16版本)[20]軟件進行Fst值的計算,同時基于重測序基因型數(shù)據(jù),利用GENEPOP 4.0.10軟件[21]分別統(tǒng)計這些SNP位點在小管福壽螺和斑點福壽螺中的等位基因頻率信息,挑選Fst值和等位基因頻率在兩種福壽螺間存在較大差異的SNP位點用于物種鑒定.

1.3 基于Sanger測序SNP驗證

基于小管福壽螺基因組測序信息,將篩選的位點定位在基因組上,利用TBtools軟件[22]提取該SNP位點上下游各200 bp堿基序列,利用Primer Premier 5.0軟件[23]進行引物設(shè)計. 隨機選取4個小管福壽螺樣本,進行PCR擴增,利用Sanger測序驗證SNP位點是否存在雙峰,若擴增產(chǎn)物出現(xiàn)不同峰值,即認為該位點在群體內(nèi)存在多態(tài)性. PCR反應(yīng)體系為20 μL:10 μL Premix Taq,引物各1 μL,1 μL DNA和7 μL ddH2O;反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,合適的退火溫度下30 s,72 ℃延伸1 min,28個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min. 針對存在雙峰的位點,用相同的PCR條件,對剩下的福壽螺樣本進行擴增測序. 引物合成和測序均由上海邁浦生物科技有限公司完成.

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測序得到的序列用MEGA X軟件[24]分析基因序列的SNP位點,對比測序后的數(shù)據(jù)峰圖,找到峰值圖中對應(yīng)MEGA X序列里觀察到的SNP位點,二倍體純合位點記為兩個相同的堿基,顯示為單峰圖;而雜合位點則記為兩個不同的堿基,顯示為套峰,進行基因型統(tǒng)計. 使用Cervus 3.0軟件[25]計算SNP位點的觀測雜合度(observed heterozygosities,Ho),期望雜合度(expected heterozygosities,He)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC). 使用GENEPOP 4.0.10軟件進行位點間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium)檢驗和哈迪溫伯格平衡偏離檢驗(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE).

針對篩選得到的用于小管福壽螺和斑點福壽螺物種鑒定的SNP位點,依據(jù)這些SNP位點在重測序數(shù)據(jù)中得到的基因頻率信息(表1),以及48個福壽螺樣本進行Sanger測序得到的基因型信息,對這48個個體進行物種鑒定,驗證這些SNP位點用于物種鑒定的準確性. 具體分析方法參考程方圓等[26]和Jiang等[27]的研究:如果使用一個SNP位點,以SNP4為例(表1),某樣本測序結(jié)果為TT,計算該SNP位點小管福壽螺T基因頻率(0.133)的乘積,以及斑點福壽螺該SNP位點T基因頻率(0.935)的乘積,如果小管福壽螺的乘積高于斑點福壽螺,則支持此樣本為小管福壽螺,反之,則為斑點福壽螺. 如果使用2個及以上SNP位點,先按上述單個SNP標記方法分別獨立計算,再將每個SNP位點得到的數(shù)值依次相乘獲得綜合判定數(shù)值,如果小管福壽螺的綜合判定數(shù)值高,則支持此樣本為小管福壽螺,反之,則為斑點福壽螺.

表1 5個用于物種鑒定的SNP分子標記基因頻率Table 1 Gene frequency of 5 diagnostic SNP markers

利用單個(或多個)SNP位點得到的某個物種鑒定結(jié)果與實際物種鑒定結(jié)果一致時,記錄判斷正確次數(shù)1次. 基于單個SNP位點以及多個位點對48個個體進行判斷,分別統(tǒng)計判斷正確次數(shù),計算驗證準確率. 計算公式如下:R=Ncorrect/Nall×100%,式中:R為驗證準確率即判斷正確次數(shù)占總次數(shù)的比值;Ncorrect為判斷正確的次數(shù);Nall為判斷總次數(shù)[26].

2 結(jié)果與討論

2.1 SNP標記的鑒定和篩選

A:CT 基因型;B:CC 基因型;C:TT 基因型圖2 位點SNP11分型結(jié)果Fig.2 The results of genotyping in SNP11

通過與小管福壽螺參考基因組序列比較,在小管福壽螺和斑點福壽螺全基因組范圍內(nèi)共檢測到的SNP數(shù)量為27 950 000個,通過進一步過濾得到46 693個高質(zhì)量SNP位點,其中堿基轉(zhuǎn)換(transition)占55.56%,高于堿基顛換(transversion)44.44%. 位于3′-非編碼區(qū)、5′-非編碼區(qū)、基因上游、基因下游、基因間區(qū)、剪切位點和內(nèi)含子的SNP數(shù)量分別為2 593、1 088、3 392、3 007、13 454、6和24 146個,位于外顯子的SNP數(shù)量為2423個(5%),隨機選取34個SNP位點設(shè)計引物.

2.2 SNP分型

在34對引物中,有30對引物成功擴增出DNA片段. 以位點SNP11為例,測序結(jié)果如圖2所示,峰圖清晰規(guī)則,無雜峰,目標位點在不同樣本中單峰(純合)或套峰(雜合)明顯,即SNP11為潛在的SNP位點,在4個福壽螺DNA樣品的擴增測序中,共篩選到22個潛在的SNP位點(表2),準確率為64.70%. Yang等[28]基于廣東魴(Megalobramaterminalis)簡化基因組測序數(shù)據(jù)開發(fā)并驗證了30個SNP位點,準確率為83%;有研究對大西洋鱈(Gadusmorhua)的全基因組進行測序并開發(fā)和驗證 SNP,其準確率為74.60%[29]. SNP標記開發(fā)的準確率可能與不同的測序方法、質(zhì)量及深度有關(guān)[30].

表2 小管福壽螺22個SNP位點信息Table 2 Genetic information for 22 SNPs in Pomacea canaliculata

續(xù)表2 Table 2 continued

通過計算上述22個SNP位點在小管福壽螺和斑點福壽螺間的Fst值,發(fā)現(xiàn)有5個SNP位點Fst值位于前1%,且等位基因頻率信息在兩種福壽螺間有明顯差異(表1). 小管福壽螺各位點等位基因頻率差值在0.706～0.786,平均值為0.744,而該差值在斑點福壽螺數(shù)據(jù)中較大,為0.740～0.956,平均值為0.870. 兩種福壽螺各位點等位基因頻率差值在0.763～0.832,平均值為0.807,說明這些標記具有較高的鑒別能力(表1). Jiang等[27]基于前人研究的二代測序數(shù)據(jù)利用Snapshot分型方法開發(fā)了12個SNP位點用于鑒別蒙古狼(Canislupus)和家犬(C.l.familiaris),各位點在兩物種中等位基因頻率差值在0.640～0.889,平均值為0.797,具有良好的鑒別能力.

2.3 SNP位點多態(tài)性分析

對上述22個SNP位點在30個小管福壽螺樣本中進行多態(tài)性分析,結(jié)果如表2所示,22個SNP位點的平均等位基因數(shù)為2,觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)范圍分別為0～0.933和0.033～0.549,多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.032～0.466.PIC值是衡量DNA座位變異程度高低的重要指標[31]. 根據(jù)Botstein等[32]劃分的原則,PIC<0.25為低度多態(tài)性,0.250.50為高度多態(tài)性. 本研究開發(fā)的22個SNP位點中有14個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性,說明這些SNP位點在小管福壽螺遺傳多樣性研究中能提供較為有效的遺傳信息. 經(jīng)Boferroni校正后,22個位點中僅有4個位點(SNP17、SNP18、SNP20、SNP22)偏離哈迪溫伯格平衡,部分位點之間(SNP11和SNP22、SNP15和SNP18、SNP17和SNP20、SNP2和SNP15以及SNP2和SNP18)存在連鎖不平衡現(xiàn)象. 本研究中篩選的這些SNP位點能應(yīng)用于福壽螺的種群遺傳學研究.

橫坐標:分子標記個數(shù),括號內(nèi)為依次增加的SNP標記;縱坐標:分子標記累計驗證準確率.圖3 分子標記和累計驗證準確率Fig.3 SNP markers and cumulative accuracy rate

2.4 物種鑒定SNP位點驗證

盡管基因組中擁有數(shù)以百萬計的SNP位點,但使用更多的SNP位點并不代表會達到更高的分辨率. SNP是基于等位基因頻率的標記,它們在物種水平上的分辨率取決于物種之間等位基因頻率的差異[27]. 基于5個物種鑒定SNP位點在小管福壽螺和斑點福壽螺中的等位基因頻率信息,對48個福壽螺樣本進行物種鑒別驗證,結(jié)果表明當5個SNP位點分別單獨使用時,判別準確率為94.74%(SNP4)、97.37%(SNP7)、94.74%(SNP8)、84.21%(SNP11)和92.10%(SNP13). 當同時使用多個SNP位點時,判別準確率結(jié)果如圖3所示,同時使用前3個位點SNP11、SNP13和SNP4時準確率即可達到100%. Lapègue等[33]利用高通量測序數(shù)據(jù),在入侵物種長牡蠣(Crassostreagigas)和葡萄牙牡蠣(C.angulata)中成功篩選出具有較大Fst值和等位基因頻率差異的15個SNP位點用于兩個物種的準確鑒定. 本研究中使用較少的SNP位點可以達到100%的分辨率.

3 結(jié)論

本研究首次基于福壽螺重測序數(shù)據(jù),成功開發(fā)22個多態(tài)性SNP標記,可用于小管福壽螺群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究,且進一步篩選5個SNP位點用于入侵中國的小管福壽螺和斑點福壽螺物種鑒定,通過Sanger測序法在48個福壽螺樣本中進行分型驗證,結(jié)果表明,物種鑒定準確率較高(>84.21%),當同時使用3～5個SNP位點時準確率可達到100%. 為小管福壽螺和斑點福壽螺準確的種類鑒別提供了有效的工具,對于控制其快速擴散、制定有效的防控措施具有重要意義.