重組抗原免疫印跡法排查化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體假陽(yáng)性的價(jià)值

王子瑜

天津市第二人民醫(yī)院感染科 （天津 300110）

梅毒血清學(xué)檢測(cè)是現(xiàn)階段臨床診斷梅毒的主要依據(jù)，隨著醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法不斷進(jìn)步[1]。以往梅毒血清學(xué)檢測(cè)采用活梅毒螺旋體進(jìn)行轉(zhuǎn)種，而后用提純的特異性抗原蛋白進(jìn)行免疫印跡分析及血清凝集試驗(yàn)等，但該方法菌種保存及轉(zhuǎn)種成本均較高，且蛋白提純等步驟困難。近年來(lái)，臨床開始應(yīng)用基因工程抗原來(lái)進(jìn)行梅毒血清學(xué)檢測(cè)，常見的檢測(cè)方法有多重免疫測(cè)定法、酶免疫試驗(yàn)法、金磁微粒標(biāo)記免疫層析法及化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）[2]，但臨床存在無(wú)梅毒病史患者、老年人或是腫瘤患者等采用上述方法檢測(cè)呈梅毒血清學(xué)陽(yáng)性卻無(wú)法解釋的情況[3]。基于此，本研究分析重組抗原免疫印跡法（recombinant antigen western blotting，RAWB）排查CLIA 檢測(cè)梅毒螺旋體抗體假陽(yáng)性的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2020年8月于我院采用CLIA 得到的梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性的血清樣本66份，涉及患者64例（包含有明確二期梅毒臨床表現(xiàn)、高齡、病程和臨床癥狀不清晰患者及CLIA 檢測(cè)結(jié)果弱陽(yáng)性患者），男26例，女38例；年齡21～89歲，其中21～50歲34例（第1組），51～70歲13例（第2組），71～89歲17例（第3組）；出現(xiàn)二期梅毒臨床癥狀的患者15例（在第1組內(nèi)），樣本17份（有2例為治療前后雙份血清）。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者均已簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 CLIA 檢測(cè)

采用干燥管抽取患者靜脈血5 ml，以3 500 r/min 離心5 min，分離血清待測(cè)；儀器選用Abbott I2000 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)維護(hù)及保養(yǎng)，并對(duì)項(xiàng)目行質(zhì)控監(jiān)測(cè)，合格后方可進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)，即檢測(cè)梅毒螺旋體抗體，結(jié)果由儀器給出。結(jié)果判定：陽(yáng)性，S/CO 值≥1；可疑陽(yáng)性，S/CO 值≥0.8且<1；陰性，S/CO 值<0.8。

1.2.2 RAWB 檢測(cè)

采用重組抗原TP17、TP47、TP45及TP15等制備的NC膜檢測(cè)，檢測(cè)盒由康泰生物公司生產(chǎn)，最終以實(shí)驗(yàn)NC 膜條質(zhì)控條帶和對(duì)應(yīng)抗原條帶顯色情況進(jìn)行結(jié)果判定，具體為：陽(yáng)性，質(zhì)控線顯色正常，至少2條抗原線顯色；可疑陽(yáng)性，僅1條抗原線顯色；陰性，抗原線不顯色；無(wú)效，未見質(zhì)控線顯色或顯色明顯下降。

1.2.3 免疫印跡法（western blotting，WB）檢測(cè)

試劑盒由德國(guó)歐蒙公司生產(chǎn)，依據(jù)操作說明書的判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)66份樣本進(jìn)行確證試驗(yàn)，并將WB 陽(yáng)性結(jié)果作為真陽(yáng)性，操作時(shí)，取出抗原膜條并將其放入反應(yīng)槽中，加入緩沖液后于室溫下溫育，再加入稀釋過的樣本，吸走槽中液體并清洗膜條3次后加入酶結(jié)合物，經(jīng)溫育、加入底物液等操作后，將膜條放于模板中，風(fēng)干后進(jìn)行分析。結(jié)果判定：陽(yáng)性，IgG 于印跡膜出現(xiàn)針對(duì)分子量47、45、17及15 kDa 的多于1條多肽抗原條帶；可疑陽(yáng)性，僅出現(xiàn)1條多肽抗原條帶；陰性，無(wú)多肽抗原條帶出現(xiàn)。

1.3 觀察指標(biāo)

以WB 檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析CLIA 檢測(cè)結(jié)果；比較CLIA、RAWB 及WB 檢測(cè)結(jié)果；比較不同年齡組患者的RAWB 與CLIA 檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CLIA 檢測(cè)結(jié)果

CLIA 檢測(cè)第1組梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性率為94.44%（34/36），可疑陽(yáng)性率為5.56%（2/36）；CLIA 檢測(cè)第2組梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性率為92.31%（12/13），可疑陽(yáng)性率為7.69%（1/13）；CLIA 檢測(cè)第3組梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性率為82.35%（14/17），可疑陽(yáng)性率為17.65%（3/17）。

2.2 CLIA、RAWB 及WB 檢測(cè)結(jié)果比較

CLIA 與RAWB 的檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.604，P<0.05）；CLIA 與WB 的檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.500，P<0.05）；RAWB 與WB 的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.524，P>0.05），見表1。

表1 CLIA、RAWB 及WB 檢測(cè)結(jié)果比較（份）

2.3 不同年齡組患者的RAWB 與CLIA 檢測(cè)結(jié)果比較

兩種方法檢測(cè)第1組的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.727，P>0.05）；兩種方法檢測(cè)第2、3組的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.500、7.771，P<0.05），見表2。

表2 不同年齡組患者的RAWB 與CLIA 檢測(cè)結(jié)果比較（份）

3 討論

臨床常依據(jù)臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查診斷梅毒，后者包括顯微鏡檢查、血清學(xué)檢測(cè)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等[4]。由于顯微鏡檢查及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢出結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)室條件和患者感染梅毒時(shí)間等因素的干擾，因此現(xiàn)階段較常用于梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢查為血清學(xué)檢測(cè)，其中篩查試驗(yàn)包括梅毒反應(yīng)素試驗(yàn)、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)、滅活血清反應(yīng)素試驗(yàn)等，確證試驗(yàn)包括梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)、梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)、WB 和CLIA 等，但當(dāng)患者為神經(jīng)梅毒、無(wú)癥狀先天梅毒或合并人類免疫缺陷病毒/艾滋病時(shí)，采用血清學(xué)檢測(cè)診斷較困難[5]。篩查試驗(yàn)主要檢測(cè)被感染宿主早期細(xì)胞被破壞釋放出的磷脂類物質(zhì)及受刺激生成的免疫球蛋白G、免疫球蛋白M 等[6]，假陽(yáng)性率較高，在老年患者或合并惡性腫瘤、各種急性傳染病等免疫系統(tǒng)異常的患者中較多見。確證試驗(yàn)特異度高，但抗體滴度不能反映梅毒活動(dòng)性，無(wú)法判斷梅毒病程[7]。

CLIA 采取混合重組抗原（TpN15、17及47）包被的微粒與被檢測(cè)樣本中梅毒螺旋體抗體結(jié)合，測(cè)定微粒表面梅毒螺旋體抗體所結(jié)合反應(yīng)物的相對(duì)光單位（relative light unit，RLU），樣本梅毒螺旋體抗體水平與RLU 成正比，比較RLU 與臨界值，若RLU 大于臨界值，則認(rèn)為梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性；該方法效率高、成本低，已被廣泛用于臨床。WB 檢測(cè)是通過病毒特異性抗原有關(guān)試劑來(lái)檢測(cè)梅毒螺旋體抗體且其檢測(cè)靈敏度和特異度均較高，為梅毒特異性抗體確證試驗(yàn)；考慮到目前抗原成分多為人工重組抗原制備，WB 檢測(cè)的假陽(yáng)性率有所上升。本研究采取優(yōu)化改進(jìn)的特異性病原體抗原蛋白來(lái)制作免疫印跡試劑，采用RAWB 法對(duì)66份樣本的檢測(cè)結(jié)果與采取病原體活體接種和提純抗原制備的結(jié)果一致，但RAWB、WB 與CLIA 檢測(cè)結(jié)果仍存在差異。臨床上部分老年人、腫瘤患者、卒中人群及孕婦常出現(xiàn)通過CLIA 檢測(cè)呈陽(yáng)性卻無(wú)法合理解釋的情況。本研究主要選取CLIA 檢測(cè)梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性樣本，包含有明確二期梅毒臨床表現(xiàn)、高齡、病程和臨床癥狀不清晰患者及CLIA 檢測(cè)結(jié)果弱陽(yáng)性患者的血清，用以排查其中的假陽(yáng)性情況，結(jié)果顯示，RAWB 與CLIA 檢測(cè)結(jié)果存在明顯差異，分析CLIA 檢測(cè)中或存在假陽(yáng)性情況。

綜上所述，CLIA 檢測(cè)梅毒螺旋體抗體存在一定的假陽(yáng)性情況，RAWB 可幫助臨床排查假陽(yáng)性結(jié)果，當(dāng)患者CLIA檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性時(shí)，則需根據(jù)其個(gè)體特征綜合分析，必要時(shí)可通過RAWB 排查。