卵巢上皮癌CD24和Yes相關(guān)蛋白1的表達(dá)及其臨床意義

劉鑫路，吳運(yùn)萍△，張林海，何 瑤，邵啟祥

1.連云港市第二人民醫(yī)院 輸血科(連云港 222006)；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 婦科(南京 210004)；3.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室 (鎮(zhèn)江 212013)

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率位居首位，是威脅女性健康的頭號殺手[1-2]。卵巢癌一般在發(fā)病初期不易被察覺，疾病早期的病理特征較隱匿，因此造成漏診，當(dāng)患者到醫(yī)院就診時(shí)已處于疾病晚期，此時(shí)行手術(shù)治療很難達(dá)到理想效果[3]。研究[4]顯示，細(xì)胞黏附分子CD24在癌癥產(chǎn)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究[2-7]顯示，黏附分子 CD24除表達(dá)于人體的正常組織外，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與CD24的異常高表達(dá)有明顯相關(guān)性。研究[6-7]表明，CD24 在很多惡性腫瘤中有不同程度的異常表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有一定相關(guān)性，CD24是卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)志和卵巢癌的治療靶點(diǎn)。

Yes相關(guān)蛋白1 (YAP1)屬于轉(zhuǎn)錄輔助因子，是Hippo-YAP抑癌信號通路中非常重要的效應(yīng)分子，在腫瘤的調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。研究[8-16]發(fā)現(xiàn)，YAP1與多種腫瘤因子共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在人體的進(jìn)一步發(fā)展。截至目前尚無明確的分子生物學(xué)原理闡釋卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，也無CD24和YAP1二者同時(shí)在卵巢上皮癌表達(dá)情況的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過采用免疫組化等技術(shù)檢測CD24和YAP1二者在卵巢癌上皮性組織中的表達(dá)情況，并分析二者參數(shù)與卵巢癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2013年6月至2017年6月在連云港市第二人民醫(yī)院進(jìn)行切除術(shù)治療的卵巢癌患者的卵巢組織樣本為研究對象，采集44例卵巢癌患者的癌組織樣本，同時(shí)采集上述患者的正常卵巢組織標(biāo)本進(jìn)行對照研究。入組的卵巢癌患者未進(jìn)行放、化療，且相關(guān)病理數(shù)據(jù)齊全。基于國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行卵巢上皮癌分期判斷。通過蘇木精-伊紅染色法 (HE) 對采集的全部標(biāo)本進(jìn)行染色處理，由2個(gè)經(jīng)驗(yàn)豐富的主任醫(yī)師開展復(fù)查工作，提高診斷準(zhǔn)確性。

1.2 主要材料

兔抗人CD24單克隆抗體(購自美國Phygene Biotechnology Co，稀釋濃度1∶200)；兔抗人YAP1多克隆抗體(購自美國PhygeneBiotechnology Co，稀釋濃度1∶400)；免疫組化檢測試劑(購自北京金豪制藥股份有限公司)；免疫組化封閉液和相應(yīng)的試劑盒(來源于北京康藥科技)。

1.3 免疫組化

將蠟塊按厚度4 μm做連續(xù)切片，采用免疫組化免疫酶標(biāo)方法進(jìn)行檢測，使用試劑商推薦的確定含該蛋白的陽性組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)設(shè)置相應(yīng)陰性對照。對采集的樣本在顯微鏡下400倍觀察，各切片選5個(gè)視野，各視野內(nèi)確定出100個(gè)細(xì)胞。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都出現(xiàn)染色后的CD24信號，而YAP1的信號大部分出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。染色后這兩種蛋白都表現(xiàn)為黃色顆粒狀，濃度高則顏色越深。在腫瘤組織中觀察到黃色顆粒，則判斷為陽性染色，基于其中陽性染色細(xì)胞數(shù)的占比進(jìn)行表達(dá)水平劃分：不表達(dá)(-)、<10%(+)、10%～50%(++)、>50%(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于Spearman法驗(yàn)證相關(guān)性，組間差異進(jìn)行方差檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)差異進(jìn)行Bonferroni對比，基于Kaplan-Meier檢測，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 在病理特征有差異的卵巢上皮性組織中CD24和YAP1二者的表達(dá)情況

2.1.1 CD24的表達(dá)情況 通過對病理特征有差異的卵巢組織免疫組化檢測結(jié)果表明，正常組織中CD24含量很少，而在卵巢癌組織中表達(dá)高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在正常樣本中，CD24的表達(dá)水平低于癌組織的情況主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜上，同時(shí)相應(yīng)的陽性程度低(+)；卵巢癌組織中，CD24主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，表現(xiàn)為強(qiáng)陽性，陽性率也高于正常組織(表1、圖1)。

表1 CD24在不同性質(zhì)卵巢組織中的表達(dá)情況(n=44)

圖1 CD24在不同卵巢組織中的表達(dá)

2.1.2 YAP1的表達(dá)情況 正常卵巢組織中，YAP1的表達(dá)水平均不高，但在卵巢上皮癌組織中高表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常卵巢組織中，YAP1單純出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中；而在卵巢上皮癌組織中，其還出現(xiàn)在細(xì)胞核中。陽性水平結(jié)果顯示，正常卵巢組織中YAP1一般表現(xiàn)為弱陽性，卵巢上皮癌組織中則為強(qiáng)陽性(表2、圖2)。

表2 YAP1在兩種卵巢組織中的表達(dá)(n=44)

圖2 YAP1在不同卵巢組織中的表達(dá)

2.2 多組性質(zhì)不同的參數(shù)與卵巢癌上皮性組織中CD24和YAP1表達(dá)的相關(guān)性

2.2.1 CD24的表達(dá)與不同臨床參數(shù)的關(guān)系 在卵巢上皮癌組織中，CD24蛋白表達(dá)水平和腫瘤分級、分期等相關(guān)指標(biāo)均存在密切關(guān)系，具體表現(xiàn)為分期高、分化低的癌組織中CD24含量更高，但其表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的年齡等不存在相關(guān)性(表3)。

表3 CD24在不同臨床病例特征的卵巢上皮癌的表達(dá)情況

2.2.2 YAP1水平和臨床參數(shù)的關(guān)系 在卵巢上皮癌組織中，YAP1蛋白的表達(dá)水平高，同時(shí)受到樣本量等因素的影響，在研究過程中沒有確定出臨床參數(shù)和其表達(dá)水平的關(guān)系(表4)。

表4 YAP1在不同臨床病例特征的卵巢上皮癌的表達(dá)情況

2.3 CD24、YAP1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

CD24陽性的32例患者中，YAP1也為陽性的31例；CD24陰性的12例中，只有1例YAP1也為陰性。卵巢上皮癌組織中，以上兩種蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.501，P=0.035)。

2.4 CD24和YAP1的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

數(shù)據(jù)收集至2017年6月，同時(shí)對入選的44例患者進(jìn)行隨訪，隨訪截至2019年12月，有12位患者生存，32位患者死亡。采用Kaplan-Meier法分析入組患者的存活時(shí)間發(fā)現(xiàn)，CD24和YAP1二者皆陽性的表達(dá)組存活周期明顯低于非同時(shí)表達(dá)陽性組的存活周期(表5、圖3)。

表5 患者術(shù)后隨訪情況(n)

圖3 CD24和YAP1的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率位居首位，是威脅女性健康的頭號殺手[1-2]。盡管近期出現(xiàn)一些治療卵巢癌的新方法，但因卵巢自身的特殊結(jié)構(gòu)以及早期相關(guān)癥狀不易被發(fā)現(xiàn)的特點(diǎn)，給早期診斷帶來了困難，當(dāng)臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分患者已錯失最佳治療期[9-10]。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，CD24可協(xié)助腫瘤的診斷，作為一種新的指標(biāo)可應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，且在不同腫瘤細(xì)胞表面存在不同程度的高表達(dá)，該指標(biāo)也可指導(dǎo)腫瘤的預(yù)后[12]。有研究[13]提出，在腫瘤判斷方面，CD24有較高的指示價(jià)值，可作為一種高效標(biāo)志物，其表達(dá)水平高的患者預(yù)后一般較差，且對卵巢癌患者的預(yù)測價(jià)值更高。

研究[14-15]表明，YAP1在卵巢癌的調(diào)控機(jī)制上起到非常重要的作用，對癌細(xì)胞的相關(guān)組織有一定的誘導(dǎo)作用。多項(xiàng)研究[14-17]提出，YAP1在多種腫瘤中高表達(dá)，YAP1的表達(dá)水平和腫瘤患者的生存期存在密切關(guān)系。

Touboul等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CD24和YAP1都有一定程度表達(dá)，來源于腫瘤細(xì)胞的外體可表達(dá)出腫瘤的特異性及共同的抗原。目前國際主流研究[18]認(rèn)為，外體具有相應(yīng)的抗腫瘤作用，其可作為一種載體搭載抗原并將其運(yùn)輸?shù)娇乖蔬f細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)達(dá)到抗腫瘤目的。上述研究均肯定了二者在上皮癌組織中起到的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢上皮癌組織中CD24和YAP1表達(dá)水平和正常卵巢組織相比明顯增高(P<0.05)；CD24的表達(dá)水平與病理分期、分化等相關(guān)，CD24和YAP1的表達(dá)呈正相關(guān)，經(jīng)Kaplan-Moier檢測發(fā)現(xiàn)，與其他組患者相比，癌組織中這兩種蛋白同步表達(dá)陽性情況下，患者生存期會明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果提示，CD24、YAP1和卵巢上皮癌相關(guān)，二者同時(shí)陽性可作為卵巢上皮癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志。

綜上所述，CD24、YAP1 蛋白在上皮性卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與卵巢上皮癌臨床分期及年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等都存在一定相關(guān)性，提示CD24、YAP1 蛋白在卵巢上皮癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮一定作用。因此進(jìn)行臨床診斷時(shí)，可同步檢測CD24與YAP1的表達(dá)，從而對卵巢上皮癌的狀況進(jìn)行判斷，且預(yù)測其增殖、侵襲相關(guān)情況，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行演變機(jī)制的研究，可為卵巢上皮癌患者的分子靶向治療起到一定促進(jìn)作用，并提供可靠支持。但由于本研究納入樣本量較小，卵巢上皮癌的發(fā)生和演化過程中，這兩種蛋白的作用機(jī)制尚不明確，需要開展大樣本研究，更好地滿足臨床應(yīng)用要求。