人胃癌細(xì)胞Caveolin-1基因的表達(dá)與DNA甲基化修飾之間的關(guān)系研究

毛立祺 戴春艷 金威洋 傅宇斐 陳喆 呂賓 王曦

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院浙江省消化道疾病病理生理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310006 2.湖州市第一人民醫(yī)院 3.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康和生命的最常見惡性腫瘤之一，在世界所有癌癥死亡率中排名第二[1]。胃癌發(fā)生早期，多數(shù)患者無明顯癥狀，而多數(shù)患者診斷出胃時(shí)都已經(jīng)發(fā)展為進(jìn)展期胃癌。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，超過50%的胃癌患者會(huì)選擇外科手術(shù)治療，但是術(shù)后約60%～70%會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。一般而言，胃癌患者平均5年生存率約22%，其中晚期胃癌患者5年生存率小于5%[2-3]。

小窩蛋白-1或窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）分子量22kDa，是胞膜窖（caveolae）的標(biāo)志性蛋白，是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選抑癌基因，在很多生理和病理過程中扮演著重要的角色，不僅參與細(xì)胞內(nèi)吞、膽固醇運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成等過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為也密切相關(guān)[4]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1在胃上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著胃癌的發(fā)生和發(fā)展而呈進(jìn)行性下調(diào)乃至缺失[5-7]；而胃癌晚期，Cav-1的表達(dá)再次升高，且與胃癌晚期患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[8]。研究表明，腫瘤晚期Cav-1的再次高表達(dá)能夠提高腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及對(duì)抗腫瘤藥物的耐受能力，并抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞存活[9-10]。由此可見，Cav-1在腫瘤發(fā)生、早期轉(zhuǎn)化以及惡性發(fā)展中的作用存在異質(zhì)性，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄前水平和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，且該基因的表達(dá)變化與甲基化修飾導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄活性改變有關(guān)[11]。越來越多證據(jù)指出，基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控是引起基因轉(zhuǎn)錄活性改變，導(dǎo)致基因功能異?；騿适У闹饕问絒12-15]。因此，本研究擬探討甲基化修飾對(duì)胃癌Cav-1基因表達(dá)的影響，以期為胃癌的臨床治療尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞（gastric epithelial cells，GES1）、人胃癌細(xì)胞系MGC-803和AGS均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫/干細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 洛斯韋爾·帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)：22400105、11765062）；胎牛血清購(gòu)于蘭州民海生物有限公司（批號(hào)：SA112.02）；含0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶購(gòu)于杭州吉諾生物有限技術(shù)公司（批號(hào)：GNM25200）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑均購(gòu)于大連寶生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：RR036A、RR091A）；總DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega Bio-tek公司（批號(hào)：R6731-001）；甲基化熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Zymo生物有限公司（批號(hào)：D5310）。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 DK-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機(jī)、ABI 7900型實(shí)時(shí)熒光PCR儀和3131型二氧化碳培養(yǎng)箱均為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；ND-1000型分光光度計(jì)購(gòu)于基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES1、MGC-803和AGS細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的水套式細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）檢測(cè)Cav-1基因的mRNA水平 使用總DNA/RNA提取試劑盒，同時(shí)提取各細(xì)胞系的基因組DNA和總RNA?？俁NA定量后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用β-actin作為內(nèi)參（NM_001101.3），以Real-time qPCR分別檢測(cè)各細(xì)胞系的Cav-1、Cav-1α和Cav-1β的mRNA表達(dá)水平，其中Cav-1的引物檢測(cè)區(qū)域包含了Cav-1α和Cav-1β兩種亞型的蛋白質(zhì)編碼 （coding sequence，CDS）區(qū)；Cav-1α的引物檢測(cè)區(qū)域僅包含Cav-1α的CDS區(qū)（NM_001753.4）；Cav-1β的引物檢測(cè)區(qū)域僅包含Cav-1β的CDS區(qū)（NM_001172895.1），引物序列見表1。以反應(yīng)達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）值，來計(jì)算每種基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of Real-time qPCR

1.2.3 甲基化熒光定量PCR檢測(cè)Cav-1α甲基化水平分別取MGC-803和AGS細(xì)胞基因組DNA 20ng，與一步法甲基化熒光定量PCR試劑盒內(nèi)的檢測(cè)緩沖液和參照緩沖液混合后，轉(zhuǎn)入384孔板內(nèi)，以人全甲基化和未甲基化DNA為對(duì)照，對(duì)Cav-1α啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)緩沖液組反應(yīng)達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)為CT檢測(cè)值，參照緩沖液組的循環(huán)數(shù)為CT參照值，以兩者之差來計(jì)算不同胃癌細(xì)胞株該區(qū)域的甲基化水平，甲基化水平=100×2CT檢測(cè)值-CT參照值，引物序列見表2。

表2 甲基化Real-time qPCR引物序列Tab.2 Primer sequences of Real-time qPCR for methylation detection

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人Cav-1基因的表達(dá)與其亞型的關(guān)系 Real-time qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGC-803細(xì)胞系的Cav-1表達(dá)為GES1細(xì)胞的（1.782±0.489）倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），而AGS1中Cav-1的表達(dá)是GES1的（0.017±0.002）倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1A。由此，本研究篩選到了Cav-1高表達(dá)和Cav-1低表達(dá)的胃癌細(xì)胞系，進(jìn)一步分別檢測(cè)了三個(gè)細(xì)胞系Cav-1α和Cav-1β的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGC-803細(xì)胞中Cav-1α的mRNA表達(dá)水平是GES1細(xì)胞的（2.604±0.945）倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而AGS細(xì)胞中Cav-1α的mRNA表達(dá)是GES1細(xì)胞的（0.0005±0.00003）倍，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1B。MGC-803和AGS細(xì)胞比較，Cav-1β的mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1C。以上結(jié)果提示，對(duì)于人胃癌細(xì)胞系Cav-1基因mRNA的表達(dá)水平的改變主要與其α亞型的表達(dá)改變有關(guān)。

圖1 GES1、MGC-803和AGS細(xì)胞中Cav-1基因及其兩種亞型的mRNA表達(dá)情況比較Fig.1 Comparison of the expression of Cav-1 and its two isoform mRNA in GES1，MGC-803 and AGS cell

2.2 人Cav-1基因磷酸胞苷酰（基）鳥苷（cytidylyl phosphate guanosine，CpG）島的預(yù)測(cè) 利用在線軟件MethPrimer -Design Primers for Mehtylation PCRs（http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html），針對(duì)Cav-1α的啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)的CpG島區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅Cav-1α的啟動(dòng)子區(qū)存在CG位點(diǎn)富集的CpG島區(qū)域，大小為174bp，包含了17個(gè)CG位點(diǎn)。根據(jù)甲基化限制酶的酶切位點(diǎn)，將該段CpG島分為兩個(gè)片段進(jìn)行分析和檢測(cè)，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcription start site，TSS）為+1，第1個(gè)片段在TSS的上游-250～-159的區(qū)域內(nèi)，包含7個(gè)CG位點(diǎn)；第2個(gè)片段在TSS上游的-158～-77的區(qū)域內(nèi)，包含10個(gè)CG位點(diǎn)。見圖2。

圖2 人Cav-1α基因CpG島預(yù)測(cè)Fig.2 Analysis in the CpG island of human Cav-1α gene

2.3 不同胃癌細(xì)胞系人Cav-1基因CpG島內(nèi)的甲基化水平比較 針對(duì)上述CpG島內(nèi)的兩個(gè)區(qū)域，經(jīng)過甲基化qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于MGC-803（Cav-1+/+）細(xì)胞系而言，第1個(gè)區(qū)域的甲基化水平為（41.4±11.0）%，第2個(gè)區(qū)域的甲基化水平為（5.6±0.6）%；對(duì)于AGS（Cav-1-/-）細(xì)胞系而言，第1個(gè)區(qū)域的甲基化水平為（12.9±6.6）%，第2個(gè)區(qū)域的甲基化水平為（75.2±27.6）%。 見圖3。 由此可見，MGC-803（Cav-1+/+）細(xì)胞系Cav-1α的高表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)區(qū)域的低甲基化水平相一致，同樣AGS（Cav-1-/-）細(xì)胞系Cav-1α的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)區(qū)域的高甲基化水平相符合。由此推測(cè)，胃癌細(xì)胞系中Cav-1α的mRNA表達(dá)水平可能與其基因啟動(dòng)子區(qū)第2個(gè)區(qū)域內(nèi)的10個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化修飾程度密切相關(guān)。

圖3 MGC-803和AGS細(xì)胞Cav-1α基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平比較Fig.3 Comparison of methylation level of Cav-1α at the promoter region in MGC-803 and AGS cell

3 討論

胞膜窖（Caveolae）是存在于分化的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞胞膜上的燒瓶狀胞膜內(nèi)陷結(jié)構(gòu)[16]，該結(jié)構(gòu)的存在有利于多種受體和信號(hào)分子如蛋白激酶、G蛋白和黏附分子在胞膜上的富集，并為多種信號(hào)分子之間的相互作用提供場(chǎng)所[17]。Cav-1即窖蛋白-1，具有α和β兩種亞型，是胞膜窖重要的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白，其作為腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、侵襲、黏附、細(xì)胞凋亡和代謝等多個(gè)過程[18]，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。

以往研究認(rèn)為，Cav-1表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致促細(xì)胞增殖的絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路和促細(xì)胞存活的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路的過度活化[19]，參與肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和骨肉瘤等多種腫瘤的早期轉(zhuǎn)化和發(fā)展[20-23]。然而，近年來研究表明Cav-1具有抗凋亡、促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移和提高腫瘤耐藥的潛力[24-27]。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株[28]、結(jié)直腸癌5-氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞株[29]、肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞株[30]中，均檢測(cè)到Cav-1的高表達(dá)，提示化療耐藥與Cav-1表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。由此可見，Cav-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)階段存在差異性表達(dá)的特點(diǎn)，而其表達(dá)水平的高低與不同時(shí)期腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為差異密切相關(guān)。因此，闡明影響Cav-1基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，有利于在腫瘤進(jìn)展的不同階段獲得針對(duì)性干預(yù)靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)傳統(tǒng)中藥能夠通過對(duì)靶點(diǎn)蛋白的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌的治療作用[31]。由此可見，深入闡明Cav-1基因的甲基化修飾機(jī)制也可為中藥抗腫瘤治療提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究分別選擇Cav-1高表達(dá)和低表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MGC-803和AGS，試圖尋找影響胃癌細(xì)胞中Cav-1基因表達(dá)變化的原因，并進(jìn)一步探索不同胃癌細(xì)胞中Cav-1基因的兩種亞型Cav-1α和Cav-1β的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cav-1基因的mRNA表達(dá)與其α亞型的mRNA水平相一致，而與β亞型的表達(dá)無明顯關(guān)系。以往研究證實(shí)，DNA的甲基化往往抑制基因的活化，而DNA的去甲基化則能夠誘導(dǎo)基因的重新活化和表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在MGC-803細(xì)胞中Cav-1α TSS的上游-158～-77區(qū)域內(nèi)的CG位點(diǎn)的甲基化修飾水平非常低，僅為5.6%；而其mRNA表達(dá)水平是正常胃上皮細(xì)胞的2.6倍；而AGS細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平僅為正常胃上皮細(xì)胞的0.0005倍，相同啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平高達(dá)75.2%?？梢?，DNA甲基化的修飾程度直接關(guān)系到其mRNA表達(dá)水平的高低，并且與Cav-1α基因的轉(zhuǎn)錄活性呈負(fù)相關(guān)。本研究提示該區(qū)域內(nèi)10個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化修飾程度與Cav-1α基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，而具體哪個(gè)位點(diǎn)或哪些位點(diǎn)的表觀修飾水平影響了Cav-1基因的表達(dá)，參與了胃癌哪一特定的發(fā)生發(fā)展階段，非常值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，胃癌細(xì)胞Cav-1基因的表達(dá)高低主要取決于其編碼的α亞型，并且其啟動(dòng)子區(qū)-158～-77的甲基化程度決定了Cav-1α基因的轉(zhuǎn)錄激活水平。該結(jié)果提示基因的甲基化修飾機(jī)制可能是影響Cav-1基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控途徑，Cav-1α亞型的甲基化修飾的改變可能是造成其在胃癌發(fā)生不同階段表達(dá)水平不同的主要原因，這一證據(jù)可以為胃癌早期診斷以及胃癌晚期化療方案的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。