葦狀羊茅EST-SSR標(biāo)記在草甸羊茅和多年生黑麥草的通用分析

王子玥， 劉 曼， 劉凌云， 常智慧

(北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083)

草甸羊茅(FestucapratensisHuds)是禾本科羊茅屬的多年生草本植物，其植株高大、分蘗力強(qiáng)、葉量大，且耐酸、耐堿，營(yíng)養(yǎng)豐富[1]，是一種優(yōu)良的牧草和草坪草，在我國(guó)主要分布于新疆伊犁。多年生黑麥草(LoliumperenneLam)是禾本科黑麥草屬的多年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲、亞洲和北非，是全球溫帶地區(qū)最廣泛栽培的多年生冷季型草，主要用于草坪建植和牧草栽培[2]。草甸羊茅、多年生黑麥草這兩種草與葦狀羊茅(FestucaarundinaceaSchred)具有很近的親緣關(guān)系，是優(yōu)良的屬間、種間雜交材料[3-6]。目前已有‘Johnstone’，‘Perny’，‘南農(nóng)一號(hào)’三個(gè)羊茅-黑麥草品種通過國(guó)審[7]。

然而，種質(zhì)資源評(píng)價(jià)體系不明確、選擇周期長(zhǎng)，阻礙了育種工作的順利進(jìn)行。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)相比，DNA標(biāo)記受環(huán)境影響較小，能夠反映真實(shí)的遺傳多樣性。微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeats，SSRs)具有高多態(tài)性、基因組廣泛分布、共顯性和可重復(fù)性等特點(diǎn)，常被用于遺傳分析[8]，主要包括基因組SSR和表達(dá)區(qū)SSR兩種。其中表達(dá)序列標(biāo)簽(Experssed sequence tags，EST)SSR來自于相對(duì)保守的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，故在物種間有較好的通用性[9]。Ram等[10]采用了一套由甘蔗(Saccharumofficinarum)EST序列開發(fā)的60個(gè)SSR標(biāo)記來研究它們?cè)诓煌蓊惢蚪M的轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)上述標(biāo)記在蔗茅屬(Erianthus)、斑茅(Sclerostchya)、芒屬(Miscanthus)轉(zhuǎn)移率高達(dá)93.3%，86.3%和83.3%。張燕梅等[11]研究表明，劍麻(AaavesisalanaPerr)中的100對(duì)EST-SSR引物在龍舌蘭屬(Agave)、絲蘭麻屬(Yucca)、中美麻屬(Furcraeavent)中分別有68，52和52對(duì)引物擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物所占比例分別為68%，52%和52%。

黑麥草屬(Lolium)和羊茅屬(Festuca)雜交范圍很寬，種、屬間均可雜交，且存在較大變異性，中間類型多，種的界限不清晰，加大了育種研究的難度。而且，目前針對(duì)草甸羊茅的研究較少，開發(fā)標(biāo)記不足。鑒于多年生黑麥草和草甸羊茅市場(chǎng)價(jià)值大，育種周期長(zhǎng)，亟需開發(fā)出更有效的EST-SSR用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。因此本研究選用40對(duì)EST-SSR引物對(duì)18份多年生黑麥草和18份草甸羊茅進(jìn)行通用性分析，以期為兩種種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種及種質(zhì)資源合理利用提供更豐富的標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)資源的收集

供試36份俄羅斯野生種質(zhì)(表1)均由全國(guó)畜牧總站提供，其中包含了18份多年生黑麥草和18份草甸羊茅。此外，為了方便處理，本研究對(duì)36份種質(zhì)進(jìn)行了重新編號(hào)。

表1 36份種質(zhì)信息表

1.2 基因組DNA的提取和EST-SSR標(biāo)記

田間每份種質(zhì)隨機(jī)選擇5株，采集新鮮葉片樣品于—20℃保存[12]?；旌蠘悠方?jīng)液氮研磨后使用Omega試劑盒提取DNA，其OD260/OD280均在1.7～2.0之間。將提取的DNA用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。最后，將試樣濃度稀釋至30 ng·μL-1，在三個(gè)離心管中各分裝100 μL液體，—20℃保存，用于PCR反應(yīng)。

EST-SSR引物由Saha等[13]設(shè)計(jì)的157條引物中隨機(jī)挑選40條(表2)，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。使用10 μL PCR反應(yīng)體系，含有5 μL 2×Taq Master Mix(KT205，北京天根有限公司)，0.2 μmol·L-1各引物，2 μL樣品DNA和2.6 μL無菌水[14]。利用Bio-Rad T100 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性50 s，59℃～64℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物在8.0%聚丙烯酰胺非變性凝膠上分離并通過銀染法顯現(xiàn)，使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存，用于后續(xù)分析。

表2 40條葦狀羊茅EST-SSR標(biāo)記信息

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按“有”或“無”條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的標(biāo)記為“1”，無條帶記為“0”[15]。遺傳距離及聚類分析采用NTSYS軟件分析；等位基因數(shù)(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(The number of effective alleles，Ne)、Nei基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity，H)、Shannon信息指數(shù)(The Shannon information index，I)采用POPGEN 32計(jì)算[16]；引物的多態(tài)性信息含量(The polymorphic information content，PIC)值采用公式：PICi=2fi(1—fi)計(jì)算，其中PICi為標(biāo)記i的多態(tài)信息量，fi為第i種等位基因占總基因數(shù)的比率，1—fi是缺少的基因頻率[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葦狀羊茅EST-SSR標(biāo)記在多年生黑麥草和草甸羊茅中的通用性

選取40 對(duì)EST-SSR引物對(duì)來自俄羅斯的18份野生多年生黑麥草和18份草甸羊茅進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中20對(duì)引物能在多年生黑麥草中擴(kuò)增出清晰、有多態(tài)性位點(diǎn)的條帶，22對(duì)引物在草甸羊茅中擴(kuò)增出清晰、有多態(tài)性位點(diǎn)的條帶。結(jié)果表明，葦狀羊茅中開發(fā)的SSR引物在草甸羊茅和多年生黑麥草這兩個(gè)近緣屬中是可以通用的，且引物通用性分別為55%和50%(表3)。

表3 EST-SSR標(biāo)記在兩個(gè)草種中的通用性信息

2.2 EST-SSR擴(kuò)增所得條帶分析

2.2.1草甸羊茅擴(kuò)增條帶分析 結(jié)果表明22對(duì)引物在草甸羊茅中共擴(kuò)增出212個(gè)條帶，多態(tài)性條帶總數(shù)為190條，多態(tài)帶百分率為89.62%；平均每對(duì)引物擴(kuò)增出9.6個(gè)條帶，22對(duì)引物所擴(kuò)增出的多態(tài)條帶數(shù)在4(NFA047)～13(NFA036)之間，平均多態(tài)性條帶數(shù)為8.6。

圖1 18份草甸羊茅種質(zhì)的擴(kuò)增條帶

2.2.2多年生黑麥草擴(kuò)增條帶分析 結(jié)果表明20對(duì)引物在18份多年生黑麥草中共擴(kuò)增出203個(gè)條帶，多態(tài)性條帶總數(shù)為182條，多態(tài)性條帶百分率89.67%，其百分率與草甸羊茅中的相似；平均每對(duì)引物擴(kuò)增出10個(gè)條帶，20對(duì)引物所擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)在4(NFA047)～16(NFA129)之間，平均多態(tài)性條帶數(shù)為9.1。

圖2 18份多年生黑麥草種質(zhì)的擴(kuò)增條帶

2.3 UPGMA聚類分析

2.3.1草甸羊茅UPGMA聚類分析 聚類圖顯示，18份草甸羊茅的遺傳距離在0.59～0.86之間，說明其遺傳多樣性處于較高水平。對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相關(guān)性系數(shù)為r=0.873，說明聚類結(jié)果可靠。在遺傳距離為0.66時(shí)，M18被單獨(dú)聚為一類，其余17份草種被聚為一類。在遺傳距離0.688處18份草甸羊茅被聚為三類，M10，M18被分別單獨(dú)聚為一類。另外M14和M15的遺傳距離相同。

圖3 18份草甸羊茅的UPGMA聚類圖

2.3.2多年生黑麥草UPGMA聚類分析 聚類圖顯示，18份多年生黑麥草的遺傳距離在0.65～0.84之間。對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相關(guān)性系數(shù)為r=0.796，說明聚類結(jié)果可靠。在遺傳距離為0.66時(shí)，R18被單獨(dú)聚為一類，其他17份草種被聚為另一類。在遺傳距離0.70處25份黑麥草被聚為三類，R7，R8，R9被聚為一類，R18被單獨(dú)聚為一類。另外在遺傳距離為0.84時(shí)R1和R3的遺傳距離相同，該種質(zhì)的同源性較高?？偟膩碚f草甸羊茅種質(zhì)較多年生黑麥草遺傳多樣性高，且UPGMA聚類圖準(zhǔn)確性更高。

圖4 18份多年生黑麥草的UPGMA聚類圖

2.4 不同材料間的遺傳參數(shù)

2.4.1草甸羊茅的遺傳參數(shù) 18份參試草甸羊茅資源的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)以及Shannon信息指數(shù)(I)平均值分別為1.845，1.337，0.212，0.336。PIC值用于比較各種標(biāo)記的多態(tài)性潛力，草甸羊茅中PIC值范圍在0.132～0.340之間，平均值為0.212。

表4 18份草甸羊茅的遺傳參數(shù)

2.4.2多年生黑麥草的遺傳參數(shù) 18份參試黑麥草資源的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性指數(shù)(H)以及Shannon信息指數(shù)(I)平均值分別為1.865，1.339，0.214，0.341。在多年生黑麥草中PIC值最大為0.316，平均值為0.214，該值略高于在草甸羊茅中的參數(shù)。

表5 18份多年生黑麥草的遺傳參數(shù)

2.5 指紋圖譜

擴(kuò)增出的條帶按“0”，“1”規(guī)則讀數(shù)，并用不同顏色表示(其中黑色代表“1”，白色代表“0”)，每個(gè)樣品的引物擴(kuò)增數(shù)據(jù)組合即為該樣品的DNA指紋圖譜。36份種質(zhì)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，引物中NFA103，NFA140可以直接區(qū)別出草甸羊茅和黑麥草(圖5)。其中引物NFA103在多年生黑麥草中同時(shí)存在Loc8，Loc9和Loc11三個(gè)位點(diǎn)，與草甸羊茅不同，引物NFA140在草甸羊茅中存在一條特異性條帶LocD，可以直接通過這些等位基因區(qū)別供試草甸羊茅和多年生黑麥草。

圖5 引物NFA103和FA140對(duì)于36份種質(zhì)的指紋圖譜

3 討論

從不同物種獲得的EST在SSR基序的側(cè)翼序列中顯示出基因組間的高度同源性[18]。因此，根據(jù)從一個(gè)作物物種獲得的EST序列設(shè)計(jì)的標(biāo)記，可用于沒有或有限SSR信息的相關(guān)植物物種的遺傳改良。黑麥草屬和羊茅屬曾同被劃分為羊茅族[19]，葦狀羊茅、多年生黑麥草、草甸羊茅有著極近的親緣關(guān)系。雖然Alm等[20]使用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphisms，RFLPs)和黑麥草SSRs為草甸羊茅構(gòu)建了遺傳連鎖圖，但是依據(jù)草甸羊茅自身EST序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記罕見報(bào)道，草甸羊茅中的可用標(biāo)記十分有限。從葦狀羊茅EST-SSR標(biāo)記中尋找適用于草甸羊茅和多年生黑麥草的引物既可以節(jié)約引物開發(fā)成本，又能提高引物的利用效率。本試驗(yàn)利用葦狀羊茅引物的通用性成功的為草甸羊茅開發(fā)了22條新標(biāo)記資源。40對(duì)引物在多年生黑麥草和草甸羊茅中的通用性比例為50%和55%，兩個(gè)比例比林榕燕、遲恩惠、秦雪等人的研究低[21-23]，其原因可能是不同植物基因組中編碼序列保守程度以及突變頻率不同。此外，在植物中，一般核心單元三核苷酸堿基重復(fù)類型的SSR通用性比例最高，其次是二核苷酸堿基重復(fù)類型[24]。本文所用引物兩種重復(fù)類型占比為90%，而上述三人的供試引物均由二核苷酸和三核苷酸重復(fù)組成。

種質(zhì)資源是開展育種工作的材料基礎(chǔ)，對(duì)種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)工作是推動(dòng)資源進(jìn)一步開發(fā)利用的前提[25]。在多年生黑麥草中，F(xiàn)aville等[26]對(duì)14 767個(gè)單基因分析，開發(fā)了310對(duì)有效SSR引物，構(gòu)建兩個(gè)親本的遺傳圖譜。蒙宇等[27]用23對(duì)SSR引物對(duì)45份來自于24個(gè)不同國(guó)家的多年生黑麥草資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出78條清晰可識(shí)別條帶，其中多態(tài)性條帶有54條，占比69.2%，PIC值為0.082～0.499，平均值為0.324。本研究中多態(tài)性條帶的占比較高，但是PIC均值略低，不過PIC均值與劉凌云等[14]在苔草中的研究數(shù)據(jù)相近。其原因可能是本研究中供試材料的遺傳多樣性不高，本試驗(yàn)中，供試材料18份多年生黑麥草的遺傳距離在0.65～0.84之間，18份草甸羊茅的遺傳距離在0.59～0.86之間，與陳志祥、伍越等[28-29]的研究相比，這36份俄羅斯野生種質(zhì)遺傳多樣性處于中等水平。因此，就育種工作而言，一個(gè)地區(qū)的少量資源是不夠的，還需要注重種質(zhì)資源地理來源的跨度，增加育種親本遺傳的多樣性。聚類結(jié)果顯示草甸羊茅中的M10和M18，多年生黑麥草中的R18，與其他供試草種遺傳距離最遠(yuǎn)，說明這3個(gè)材料遺傳背景差異較大，具有較強(qiáng)的遺傳潛力。而M14和M15，R1和R3具有極高的親緣關(guān)系，說明這些資源具有相似的起源或者經(jīng)過更多的基因交流[30]。

最后，本研究發(fā)現(xiàn)引物NFA103和引物NFA140分別存在3條和1條特異性條帶，能夠極其迅速的區(qū)別開兩個(gè)草種。該引物可能對(duì)羊茅屬間、羊茅屬和黑麥草屬間的分類具有重要意義，同時(shí)在實(shí)際應(yīng)用中具有很大價(jià)值，但是受樣本數(shù)限制，該引物的鑒定效果有待進(jìn)一步確認(rèn)。其他引物結(jié)果并不能顯著區(qū)別兩個(gè)植物種，種間鑒別的概率不高。而且，當(dāng)涉及基因組某個(gè)DNA序列或一個(gè)染色體的變化時(shí)，SSR標(biāo)記是不適用的[31]。目前羊茅-黑麥草品種已經(jīng)開始廣泛使用，單獨(dú)使用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析是片面的。因此，在后續(xù)羊茅屬、黑麥草屬草種的遺傳分析中，還需要從解剖學(xué)特征、表觀性狀、質(zhì)量性狀等多角度進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

40對(duì)葦狀羊茅EST-SSR引物在18份草甸羊茅和18份多年生黑麥草中的通用性比例分別為55%和50%；36份種質(zhì)遺傳多樣性處于中等水平，但仍是優(yōu)良的育種材料，其中草甸羊茅種質(zhì)比多年生黑麥草遺傳多樣性高；引物NFA103和引物NFA140分別存在3條和1條特異性條帶，能夠極其迅速的區(qū)別兩個(gè)草種，但是受樣本數(shù)限制，該引物的鑒定效果有待進(jìn)一步確認(rèn)。