60Coγ輻射柱花草M3代的農(nóng)藝性狀及遺傳多樣性分析

羅銘欣, 劉鳳民, 陳紀(jì)言,3, 崔均濤, 張偉麗,3*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院， 廣東 廣州 510225; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教學(xué)科研基地管理中心， 廣東 廣州 510225;3.德慶仲愷農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新研究有限公司， 廣東 肇慶 526642; 4仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院， 廣東 廣州 510225)

柱花草(Stylosanthesspp.)是一種熱帶豆科牧草，其莖葉產(chǎn)量大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性強(qiáng)、耐酸性土壤，具有固氮、改良土壤和涵養(yǎng)水土的作用，可用作綠肥作物、青飼料等[1-2]。柱花草起源于哥倫比亞和巴西，主要分布在南美洲，現(xiàn)已被推廣于我國(guó)的干熱河谷地區(qū)，成為我國(guó)熱帶草業(yè)的優(yōu)勢(shì)豆科牧草，并有“北有苜蓿，南有柱花草”之說(shuō)[3-4]。

輻射誘變育種是利用理化因素(如X射線、γ射線等)在短時(shí)間內(nèi)撞擊生物體輻射其敏感部位發(fā)生電離而引起DNA結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而使其產(chǎn)生新的突變體，用于輔助新品種的改良和培育[5-6]。分子標(biāo)記技術(shù)可直接反映DNA分子水平的遺傳變異，能闡述植物間的遺傳關(guān)系，可為雜交育種中的親本選配提供理論依據(jù)。CDDP是基于DNA保守序列的分子標(biāo)記技術(shù)，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可直接用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，具有成本低、目標(biāo)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[7]。SRAP是一種利用獨(dú)特的雙引物對(duì)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記技術(shù)，具有測(cè)序簡(jiǎn)便、有適度的吞吐比、高共顯性、適用于基因的定位等優(yōu)點(diǎn)[2,8]。傳統(tǒng)表型選擇可能會(huì)丟失一些表型較差個(gè)體所攜帶的優(yōu)良低頻基因，而分子標(biāo)記則能有效地尋找和定位這些基因[9]。每種分子標(biāo)記都有自身的長(zhǎng)處和不足，采用不同分子標(biāo)記技術(shù)得出的多態(tài)性結(jié)果也存在差異，所以本研究同時(shí)運(yùn)用CDDP和SRAP標(biāo)記對(duì)經(jīng)60Coγ射線輻射的17份柱花草M3代種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期更加準(zhǔn)確地尋找和定位這些優(yōu)良基因。

目前，關(guān)于柱花草遺傳多樣性的研究多利用SRAP[2,10]，SSR[11]，SSR和SRAP[3,12]，RAPD[13-16]，AFLP[17]，RFLP[18]，RFLP和STS[19]，ISSR[4]等分子標(biāo)記方法進(jìn)行遺傳差異分析，但尚未見(jiàn)CDDP標(biāo)記應(yīng)用于柱花草的報(bào)道，且目前應(yīng)用SRAP標(biāo)記確定輻射變異后柱花草的遺傳多樣性分析較少，僅有劉鳳民等[20]和張偉麗等[21]利用SRAP分析輻照后柱花草M1代和M2代確定輻射后柱花草在分子水平的變異，經(jīng)輻照處理的種子會(huì)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，在M1代通常會(huì)出現(xiàn)形態(tài)畸變、生理?yè)p傷和DNA損傷等，而在M2代將確定優(yōu)秀變異植株作為目標(biāo)株系，在M3代繼續(xù)觀察篩選出目標(biāo)突變株。

本研究對(duì)60Coγ射線輻照后的M3代柱花草進(jìn)行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)，并采用CDDP和SRAP標(biāo)記對(duì)17份M3代柱花草種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，這將有利于優(yōu)良柱花草種質(zhì)的發(fā)掘，并對(duì)分子標(biāo)記輔助柱花草的輻射誘變育種工作具有一定的指導(dǎo)意義，為柱花草種質(zhì)資源的利用、親本選擇以及品種改良提供材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用柱花草品種為‘Nchp1’、‘熱研2號(hào)’(‘Reyan No.2’)、‘熱研13號(hào)’(‘Reyan No.13’)的種子，經(jīng)劑量為974Gy的60Coγ射線輻射誘變處理后種植[20]，連續(xù)2代對(duì)自然生長(zhǎng)的植株通過(guò)株高、干重、花期、炭疽病的病害級(jí)數(shù)等主要指標(biāo)的測(cè)定與分析進(jìn)行篩選，選取出13份上述性狀優(yōu)良的單株，以及‘Nchp1’在自然生境下株型發(fā)生變異的Nchp401，加上3個(gè)未進(jìn)行輻照的親本材料，共計(jì)17份柱花草種質(zhì)作為試驗(yàn)材料(表1)，其中以‘Nchp1’，‘ReyanNo.2’為對(duì)照1，2。

表1 供試柱花草種質(zhì)資源信息

SRAP的正反引物是根據(jù)Li等[22]提出的原則構(gòu)建引物，SRAP的正反引物一一相互配對(duì)組成80對(duì)SRAP引物，而CDDP引物則參照Collard和Mackill[23]公布的引物序列，CDDP引物和SRAP引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 CDDP和SRAP引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1農(nóng)藝性狀的測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析 將篩選得到的17份M2代柱花草品系的種子浸泡于80℃的熱水中處理3～5 min，冷卻后再次浸泡于稀釋800倍的復(fù)方多菌靈(多硫) 溶液中消毒30 min，然后流水沖洗，在育種盤(pán)中播種，置于溫室大棚中，3個(gè)月后移栽到仲愷鐘村的農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)基地，每份材料分別種植在農(nóng)場(chǎng)2個(gè)不同的區(qū)域，分為一區(qū)與二區(qū)，每個(gè)區(qū)域?qū)γ糠莶牧显O(shè)置3個(gè)重復(fù)，移栽5個(gè)月后測(cè)定柱花草材料的株高、冠徑、分支數(shù)、第一分支長(zhǎng)、病害級(jí)數(shù)5個(gè)指標(biāo)，而病害級(jí)數(shù)是對(duì)柱花草炭疽病的觀測(cè)，采用Chakraborty Sukumar提供的0～9級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)柱花草炭疽病進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[24]。分別記錄柱花草的開(kāi)花期后，并于移栽后的7個(gè)月對(duì)其進(jìn)行刈割，經(jīng)烘干后稱量單株的干重。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行分析。

1.2.2基因組DNA的提取與檢測(cè) 稱取健康新鮮的柱花草嫩葉0.2 g，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取17份柱花草的DNA，所得DNA濃度與純度用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)與分析。

1.2.3CDDP-PCR和SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的確定 通過(guò)單因子試驗(yàn)對(duì)柱花草CDDP-PCR反應(yīng)體系的模板DNA量、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶量設(shè)置不同的梯度水平，在反應(yīng)過(guò)程中上述5個(gè)因素逐一變動(dòng)時(shí)保證其余反應(yīng)條件不變，通過(guò)觀察擴(kuò)增條帶的清晰度、特異性的豐富度來(lái)確定最佳的反應(yīng)體系。用引物WRKY-R3B對(duì)樣品‘RY13fszh001’的DNA擴(kuò)增，通過(guò)單因子試驗(yàn)確定柱花草CDDP-PCR的反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積為20 μL，其中DNA模板75 ng、Taq DNA聚合酶1.5 U、10×Buffer(含Mg2+2.0 mmol·L-1)2.5 μL，0.6 mmol·L-1dNTPs 1.2 μL，0.3 μmol·L-1引物濃度1 μL，用ddH2O補(bǔ)足剩余體積。CDDP-PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min、循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

SRAP-PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參考劉鳳民等[20]的方法。反應(yīng)總體積為25 μL，其中DNA模板1 μL、5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.625 μL、10×Buffer(含Mg2+2.0 mmol·L-1)2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物濃度1 μL，用ddH2O補(bǔ)足剩余體積。SRAP-PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min、33℃退火1 min、72℃延伸10 s、循環(huán)5次；94℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸10 s、循環(huán)30次；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.4PCR產(chǎn)物分離 CDDP與SRAP標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用濃度為1.5%與2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)，使用Tanon 4100凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。用80對(duì)SRAP引物對(duì)17份柱花草種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳篩選出26對(duì)能擴(kuò)增出清晰條帶、多態(tài)性高的引物。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 人工分析電泳圖譜，在相同遷移位置上，有清晰可辨認(rèn)的條帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，以此構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。

運(yùn)用NTSYS-pc 2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS)、遺傳距離(GD)，按照非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)對(duì)所有樣本作聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 17份柱花草農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析

17份柱花草的株高、冠徑、分枝數(shù)、第一分支長(zhǎng)、病害級(jí)數(shù)、開(kāi)花期、單株干重7個(gè)農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，其中‘RY13fszh001’株高最矮，顯著矮于‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh0021’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh003’，‘Nchpfszh006’，‘Nchpfszh008’，‘Nchp401’(P<0.05)。冠徑最寬的種質(zhì)為‘Nchpfszh0020’，其次為‘Nchpfszh01102’。分支數(shù)最多的種質(zhì)是‘RY2fszh001’，其次是‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfszh004’和‘Nchpfszh0021’，再者是‘Nchpfszh003’和‘Nchpfszh0020’，只有‘RY2fszh001’顯著多于其余的11份種質(zhì)(P<0.05)?！甆chpzh021’的第一分支長(zhǎng)最短，和其余16份柱花草種質(zhì)差異顯著(P<0.05)。單株干重位列前六的種質(zhì)分別為‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfs1’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh017’，‘Nchp1’，均顯著重于余下的11份種質(zhì)?！甆chpfszh0020’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘Nchpfszh017’，‘RY2fszh001’這5個(gè)種質(zhì)的單株干重都高于對(duì)照1,2，而‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘Nchpfszh017’的單株干重分別比其輻射親本Nchp1(對(duì)照1)高出93.0%，93.9%，76.9%，12.4%，‘RY2fszh001’的單株干重亦比其輻射親本‘Reyan No.2’(對(duì)照2)高出83.4%，每種農(nóng)藝性狀都出現(xiàn)好于親本或?qū)φ盏那闆r，呈現(xiàn)了經(jīng)輻射篩選后的多樣性和定向性。

炭疽病是柱花草最大的病害，對(duì)柱花草的產(chǎn)量危害極大，會(huì)導(dǎo)致柱花草頂芽病變和壞死。選育出病害級(jí)數(shù)小的柱花草種質(zhì)可以防治炭疽病，由表3可知，病害級(jí)數(shù)最小的種質(zhì)為‘Nchpfszh01102’和‘ReyanNo.13’，病害級(jí)數(shù)為0，說(shuō)明‘Nchpfszh01102’和‘ReyanNo.13’有較強(qiáng)的炭疽病抗病性。17份柱花草種質(zhì)的開(kāi)花期均集中在10—11月，其中花期最早的種質(zhì)為‘Nchpfs1’在10月10日即開(kāi)花，‘Nchpfszh0020’緊跟其后在10月12日開(kāi)花，‘Nchpfszh01102’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh003’緊接著也在10月13日開(kāi)花了，以上5份種質(zhì)的花期均早于其輻射親本，輻射后代的花期提前可以讓種植在廣東的柱花草有效地避開(kāi)寒潮的到來(lái)，避免被凍傷甚至影響正常的結(jié)籽。

表3 柱花草M3代各種質(zhì)的農(nóng)藝性狀

2.2 17份柱花草基因組DNA純度及濃度檢測(cè)

超微量分光光度計(jì)的測(cè)量結(jié)果顯示17份柱花草基因組DNA的A260/A280穩(wěn)定在1.74～1.81之間，而A260/A280在1.80左右則顯示DNA較純，沒(méi)有被降解或被RNA、多糖、蛋白質(zhì)、酚等污染，也沒(méi)有其他小分子雜質(zhì)的殘留，DNA的濃度在64.86～142.76 ng·μL-1之間，測(cè)量數(shù)據(jù)表明提出來(lái)的柱花草基因組DNA純度高、質(zhì)量穩(wěn)定能滿足分子標(biāo)記分析的要求。

2.3 柱花草種質(zhì)多態(tài)性分析

2.3.1CDDP標(biāo)記多態(tài)性分析 如表4所示，通過(guò)CDDP的17條引物對(duì)17份柱花草種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)到的條帶有92條，平均每條引物擴(kuò)增出5.4條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為66條，多態(tài)性比率高達(dá)71.7%，其中特異性條帶數(shù)為13條，特異性比率為14.1%。其中WRKY-R3與WRKY-R3B擴(kuò)增條帶數(shù)最多，均為8條，KNOX-2的擴(kuò)增條帶數(shù)目最少，只有3條，其多態(tài)性條帶數(shù)也是最少，僅擴(kuò)增出1條，而WRKY-R1的特異性條帶最多，達(dá)到了3條。另外，多態(tài)性比率達(dá)100%的引物有WRKY-R3,MADS-2,ABP1-3。引物WRKY-R1對(duì)17份柱花草的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 引物WRKY-R1對(duì)17份柱花草種質(zhì)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2SRAP標(biāo)記多態(tài)性分析 從80對(duì)SRAP引物中篩選出26對(duì)擴(kuò)增效果較好的引物組合對(duì)17份柱花草種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，如表4所示，共擴(kuò)增出177條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出6.8條帶；多態(tài)性條帶有111條，多態(tài)性比率為62.7%；特異性條帶共計(jì)29條，特異性比率為16.4%。其中引物組合ME7EM4擴(kuò)增出的條帶數(shù)目最多，達(dá)12條，而引物組合ME7EM1僅擴(kuò)增出3條帶。ME7EM4，ME8EM2與ME8EM5擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多，均為7條，而ME3EM3，ME7EM1和ME7EM6擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最少，只有2條。ME2EM2，ME6EM4和ME8EM2擴(kuò)增出多態(tài)性條帶比率最高，均達(dá)到100%，而ME2EM8，ME4EM4擴(kuò)增出多態(tài)性條帶比率最低，均為45.5%。引物組合ME7EM4對(duì)17份柱花草的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

圖2 引物組合ME7EM4對(duì)17份柱花草種質(zhì)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.3CDDP和SRAP標(biāo)記系統(tǒng)的多態(tài)性比較 如表4所示，從引物覆蓋的條帶來(lái)看，SRAP的平均覆蓋條帶數(shù)(6.8條)高于CDDP(5.4條)，且SRAP的特異性比率(16.4%)也高于CDDP(14.1%)，而CDDP的多態(tài)性比率(71.7%)高于SRAP(62.7%)(表4)，兩種分子標(biāo)記均能擴(kuò)增出較為豐富的多態(tài)性條帶，說(shuō)明篩選出的CDDP引物和SRAP引物適用于柱花草的種質(zhì)鑒定。

表4 17份柱花草種質(zhì)遺傳多樣性分析

2.4 基于CDDP和SRAP標(biāo)記分析結(jié)果下柱花草的遺傳相似性

CDDP擴(kuò)增結(jié)果如表5所示，樣本間遺傳相似系數(shù)在0.54～0.90之間，平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.76，平均遺傳距離(GD)為0.24。最大遺傳相似數(shù)0.90出現(xiàn)在‘Nchpfszh006’和‘RY2fszh001’之間，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系較近，最小遺傳相似系數(shù)0.54出現(xiàn)在‘Nchpfs1’和‘Nchpzh021’之間，表明兩者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表5 基于CDDP分子標(biāo)記柱花草的遺傳相似系數(shù)

SRAP擴(kuò)增結(jié)果如表6所示，樣本間遺傳相似系數(shù)范圍是0.60～0.94，說(shuō)明17份柱花草種內(nèi)有較大的遺傳分化，平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.79，平均遺傳距離(GD)為0.21?！甆chp401’與‘Nchpfszh017’，‘Nchp401’與‘Nchpfszh004’的遺傳相似系數(shù)均為0.60最小，說(shuō)明‘Nchp401’和兩者的遺傳距離相近；‘ReyanNo.13’和‘ReyanNo.2’的遺傳相似系數(shù)最大，為0.94，說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系最近，兩者之間可能擁有更多相同的基因組類(lèi)型。

表6 基于SRAP分子標(biāo)記柱花草的遺傳相似系數(shù)

2.5 基于CDDP標(biāo)記和SRAP標(biāo)記聯(lián)合的柱花草聚類(lèi)分析

由圖3所示，聚類(lèi)分析顯示輻射后的M3代柱花草與親本產(chǎn)生了一定的變異。系數(shù)在0.71時(shí)，將17份柱花草種質(zhì)分為2類(lèi)，其中株型特殊、自然逆境突變的‘Nchp401’單獨(dú)聚為類(lèi)群I，剩余16份柱花草種質(zhì)聚為類(lèi)群II。在系數(shù)為0.82時(shí)又被分為7小類(lèi)，‘Nchpfszh0020’和‘Nchpfszh0021’聚為一類(lèi)，其株高、冠徑、分支數(shù)、第一分支長(zhǎng)、病害級(jí)數(shù)均沒(méi)有顯著差異；而未經(jīng)過(guò)輻射的‘Reyan No.2’與‘Reyan No.13’緊密聚為一類(lèi)，兩者的花期較晚，在試驗(yàn)的17份柱花草中僅此2份品種是11月初才開(kāi)花的；病害級(jí)數(shù)沒(méi)有顯著差異的‘Nchpzh021’和‘Nchpfszh01102’聚為一類(lèi)，其與農(nóng)藝性狀中沒(méi)有顯著差異的另一聚類(lèi)‘Nchpfszh017’和‘Nchpfszh004’聚為一大類(lèi)；輻射親本‘Nchp1’與其輻射后代‘Nchpfszh003’，‘Nchpfszh006’聚為一類(lèi)，很好的反映了輻照親本與輻照后代的親緣關(guān)系，而農(nóng)藝性狀沒(méi)有顯著差異的‘Nchp1’和‘Nchpfszh006’又緊密聚類(lèi)；‘RY2fszh001’，‘RY2fszh002’，‘Nchpfszh008’，‘RY13fszh001’聚為一類(lèi)，其中‘RY2fszh001’和‘RY2fszh002’的輻射親本相同聚在一起，而除了開(kāi)花期與株高有差別以外，其他農(nóng)藝性狀均沒(méi)有顯著差異的‘Nchpfszh008’和‘RY13fszh001’也聚在一起；‘Nchp401’和‘Nchpfs1’的單獨(dú)聚類(lèi)說(shuō)明自然逆境和60Coγ射線輻射均能引起種質(zhì)一定程度的遺傳變異。

圖3 基于CDDP標(biāo)記和SRAP標(biāo)記聯(lián)合的柱花草聚類(lèi)分析

3 討論

種質(zhì)資源的遺傳多樣性是作物育種能夠取得突破性結(jié)果的關(guān)鍵[25]。遺傳多樣性是遺傳育種的基因源泉，是一個(gè)物種是否能適應(yīng)環(huán)境變化的決定因素。柱花草是自花授粉植物，雜交育種較難，育種主要依靠人工手段，而利用60Coγ射線輻射柱花草的種子育種，能夠誘導(dǎo)柱花草產(chǎn)生變異，可減輕育種的工作量與年限。分子標(biāo)記是輔助育種的重要工具，CDDP標(biāo)記是一種目的基因標(biāo)記技術(shù)，其操作簡(jiǎn)單，其引物來(lái)自轉(zhuǎn)錄因子基因家族，能涉及到抗病、發(fā)育、代謝等性狀。SRAP技術(shù)操作簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高，不需閾預(yù)知物種的序列信息，在許多植物中都可以利用，這使得SRAP技術(shù)在遺傳多樣性分析品種鑒定，指紋圖譜構(gòu)建等多個(gè)領(lǐng)域得以應(yīng)用。丁澤婷等[12]利用SSR和SRAP對(duì)20份柱花草品種進(jìn)行重要性狀的關(guān)聯(lián)分析。任羽等[26]利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)60Coy射線處理后的石解蘭組培苗進(jìn)行分析，認(rèn)為SRAP分子標(biāo)記能有效地揭示誘變材料的遺傳多樣性。本研究首次利用CDDP分子標(biāo)記分析柱花草輻射M3代的遺傳多樣性，能將其很好的區(qū)分開(kāi)。CDDP和SRAP引物對(duì)17份柱花草種質(zhì)擴(kuò)增的多態(tài)性比率分別為71.7%和62.7%，表明經(jīng)過(guò)60Coγ射線輻射后17份柱花草種質(zhì)間存在豐富的遺傳變異，兩種分子標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)各為0.76和0.79，說(shuō)明輻射處理對(duì)柱花草材料存在誘變作用，蔣昌順等[12]的多樣性水平低于本研究的多態(tài)性水平，考慮是種質(zhì)、引物的不同所引起的，也說(shuō)明了CDDP和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在柱花草屬植物遺傳多樣性研究中有較高的檢出效率，是鑒定柱花草種質(zhì)和研究遺傳多樣性的理想方法。白昌軍等[15]采用太空誘變的方式對(duì)‘熱研2號(hào)’柱花草進(jìn)行誘變后利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳性分析，其多態(tài)性比率68.8%低于本研究CDDP的多態(tài)性比率為71.7%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)60Coγ射線輻射處理后的柱花草增大了變異率，提供了更寬的遺傳篩選范圍，經(jīng)過(guò)3年的單株選擇篩選出的柱花草M3代已發(fā)生了不同程度的變異，產(chǎn)生了許多比親本優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，如炭疽病病害級(jí)數(shù)小和花期提前的柱花草種質(zhì)，這些變異材料的選擇豐富了柱花草種質(zhì)的基因類(lèi)型，極有可能從中開(kāi)發(fā)出比親本更優(yōu)良的柱花草種質(zhì)，有望為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的柱花草品種選育提供新種質(zhì)。

CDDP-PCR反應(yīng)體系中成分濃度變化會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果[27]，因此本試驗(yàn)優(yōu)化了柱花草CDDP-PCR反應(yīng)體系，為今后運(yùn)用CDDP標(biāo)記開(kāi)展柱花草遺傳多樣性、雜交育種等方面的相關(guān)研究提供了依據(jù)。SRAP引物一般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，但本試驗(yàn)中用瓊脂糖凝膠即可取得較好的分離效果，說(shuō)明對(duì)于柱花草材料，SRAP分子標(biāo)記可以采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行分離。聚類(lèi)分析是種質(zhì)資源表型多樣性研究中較為普遍有效的分析方法[28]，在進(jìn)行分析的時(shí)候?yàn)榱说玫礁鼫?zhǔn)確的聚類(lèi)結(jié)果，用不同分子標(biāo)記聯(lián)合對(duì)親緣關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)能有效減少單一標(biāo)記造成的誤差。應(yīng)用CDDP和SRAP標(biāo)記聚類(lèi)分析結(jié)果可知，柱花草的親緣關(guān)系與農(nóng)藝性狀有一定的相關(guān)性，農(nóng)藝性狀相似的更容易緊密的聚類(lèi)，分類(lèi)結(jié)果與農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果較一致，聯(lián)合兩種標(biāo)記方法能準(zhǔn)確地分析輻射后柱花草的親緣關(guān)系，對(duì)后續(xù)的育種和利用提供一定的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究利用60Coγ射線對(duì)柱花草種子進(jìn)行輻射誘變，并運(yùn)用CDDP和SRAP分子標(biāo)記快速有效地對(duì)17份柱花草進(jìn)行遺傳多樣性分析，經(jīng)60Coγ射線輻射誘變后的M3代柱花草與其輻射親本以及在自然逆境下突變的‘Nchp401’之間存在豐富的遺傳差異，本研究從分子水平上對(duì)其進(jìn)行遺傳變異分析，明確其遺傳距離，從分子水平上反映了輻射后代的變異性和差異性。結(jié)合其農(nóng)藝性狀進(jìn)行選育，系數(shù)在0.71時(shí)，將17份柱花草種質(zhì)分為2類(lèi)，其中自然逆境突變的‘Nchp401’單獨(dú)聚為類(lèi)群I，剩余16個(gè)柱花草品種聚為類(lèi)群II，其中類(lèi)群II在系數(shù)為0.82時(shí)又被分為6小類(lèi)，各小類(lèi)群間農(nóng)藝性狀關(guān)系密切，因此在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)育種目標(biāo)選擇相應(yīng)的親本材料。本研究為柱花草輻射效應(yīng)評(píng)價(jià)提供了分子依據(jù)，為柱花草的分子標(biāo)記輔助輻照選育積累經(jīng)驗(yàn)。