基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

高 雅，周欣欣，馬存根，2，張紅珍

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床學(xué)院，山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室，山西晉中030619；2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同037009）

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是由于各種因素影響，脂質(zhì)在大、中血管的內(nèi)膜沉積、平滑肌細(xì)胞和纖維組織增生、鈣質(zhì)沉積，形成黃色的粥樣斑塊，繼而造成血管腔不同程度的狹窄及血管壁的硬化［1］。AS是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，也是其惡性事件的首要原因。近年來(lái)，我國(guó)AS的發(fā)病率和死亡率上升，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，不斷年輕化成為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病趨勢(shì)［2］。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)雖取得了一定的成果，如認(rèn)識(shí)到內(nèi)膜損傷可能是其主要的原因，但是因?yàn)樵摬〔〕虝r(shí)間長(zhǎng)、病因相對(duì)復(fù)雜等特點(diǎn)，使得更深入的研究還相對(duì)不足。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯源自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能在蛋白水平調(diào)控血脂的濃度，從而改善AS癥狀。一系列的最新相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯的功效不僅在蛋白水平，同時(shí)對(duì)AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的Rho激酶、PAI-1、及eNOS等特異性標(biāo)志物都有一定的調(diào)控作用，進(jìn)而對(duì)AS的治療發(fā)揮效用［3］。有研究顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其組方成分可以調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝、降低巨噬細(xì)胞泡沫化、減少炎癥和免疫反應(yīng)、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、減小和穩(wěn)定AS斑塊，具有多方面的有效作用［4］。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，在計(jì)算機(jī)大運(yùn)算支持下對(duì)中藥成分進(jìn)行高通量組學(xué)分子生物網(wǎng)絡(luò)分析的新學(xué)科，主要用于中藥活性成分、靶點(diǎn)、通路及疾病之間關(guān)系的相關(guān)分析，在整體水平上闡明中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。本研究在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯作用于A(yíng)S的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、作用通路，為深入探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS的作用機(jī)制提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）檢索補(bǔ)陽(yáng)還五湯所含化學(xué)成分，并以口服利用度（oral bioavailabitity，OB）≥30%，類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定符合條件的活性成分。利用TCMSP提供的信息篩選出相關(guān)靶點(diǎn)，并將收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行化合物作用靶點(diǎn)的進(jìn)一步篩選。通過(guò)Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中將已篩選出的靶蛋白名轉(zhuǎn)換為靶點(diǎn)簡(jiǎn)稱(chēng)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 獲取AS靶點(diǎn)以及共同靶點(diǎn)

以“Atherosclerosis”“AS”為關(guān)鍵詞，在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與AS相關(guān)的基因。通過(guò)R語(yǔ)言中VennDiagram程序包，獲取補(bǔ)陽(yáng)還五湯與AS的共同靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

在STRING（http：//string-db.org）數(shù)據(jù)平臺(tái)輸入共同靶點(diǎn)，蛋白種屬設(shè)置為“Homosapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等“mediumconfidence”（＞0.4），分析后得到蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1可視化，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 KEGG富集

應(yīng)用DAVID對(duì)益氣活血與AS的共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto enoyclopadia of gene and genomes，KEGG）通路富集分析，保留P＜0.05的結(jié)果，然后進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 篩選出補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出補(bǔ)陽(yáng)還五湯共有86個(gè)化合物和143個(gè)作用靶點(diǎn)，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的一些化合物可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，而且不同化合物也可以同時(shí)作用于同一靶點(diǎn)，這反映了中藥中多個(gè)組分與多個(gè)靶標(biāo)之間的相互作用。

2.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯與AS共同靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得4346個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯與AS靶點(diǎn)取交集，獲得97個(gè)共同的靶標(biāo)（圖1），表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)多個(gè)潛在靶標(biāo)在治療AS中起著協(xié)同作用。

圖1 疾病與藥物靶點(diǎn)

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)97個(gè)共同靶點(diǎn)分析后，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。首先以DC值進(jìn)行篩選獲得網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)即“Bighubs”，最終篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)（表1），主要涉及炎癥與免疫、內(nèi)皮細(xì)胞功能等。

圖2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 KEGG通路富集分析

97個(gè)共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析，將前20條信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析（圖3）。其中包括自噬相關(guān)PI3K-Akt信號(hào)通路，與炎癥和免疫相關(guān)的包括白介素-17（interleu kin 17，IL-17）信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、TH17細(xì)胞分化、乏氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF-1）信號(hào)通路等；這表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能具有通過(guò)抗炎、提高免疫、激活自噬等作用以緩解AS進(jìn)程。通過(guò)剔除疾病、廣義通路后，獲得與補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS相關(guān)度最高的通路（表2）。

圖3 KEGG通路富集分析

表2 基于京都基因和基因組途徑分析百科全書(shū)的潛在靶點(diǎn)功能分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中有86個(gè)化合物，143個(gè)作用靶點(diǎn)，說(shuō)明成分具有多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。例如，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇分別作用于87、55和51個(gè)靶點(diǎn)，說(shuō)明他們可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的主要活性化合物。槲皮素和山萘酚為黃酮類(lèi)化合物，是一類(lèi)具有可變酚結(jié)構(gòu)的天然物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等特性。槲皮素干預(yù)可有效改善脂代謝紊亂，減輕AS病理改變，改善動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)，同時(shí)可顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)VSMCs及成纖維細(xì)胞的增殖以及由二者的增殖導(dǎo)致的動(dòng)脈壁膠原成分增加，延緩AS的進(jìn)展［5］。當(dāng)PI3K/Akt/NF-κB通路被激活時(shí)，促進(jìn)主動(dòng)脈壁成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖及膠原等成分的合成與分泌，加速了AS進(jìn)程；而槲皮素治療AS除影響脂代謝途徑外，也可能干預(yù)此通路中關(guān)鍵蛋白的活性、抑制NF-κB轉(zhuǎn)移，抑制主動(dòng)脈壁成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖及膠原等成分的合成與分泌，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。有實(shí)驗(yàn)指出槲皮素具有抗AS作用，不同的藥物劑量、時(shí)間均對(duì)結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。槲皮素抗AS的分子作用機(jī)制可能是源自于對(duì)高遷移率蛋白1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）、Toll樣受體（toll-like repector 4，TLR4）蛋白和基因表達(dá)的下調(diào)［6］。山奈酚通過(guò)在降脂、抗氧化及抑制血管炎癥等方面發(fā)揮作用，起到有效防治高脂誘導(dǎo)家兔AS，顯著改善其相關(guān)血管病變的功效。通過(guò)調(diào)節(jié)E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecale-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）等黏附分子的基因與蛋白的表達(dá)從而影響血管的炎癥反應(yīng)［7］。實(shí)驗(yàn)表明，攝入β-谷甾醇的甾醇型有機(jī)凝膠劑的大鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等的含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，證實(shí)了其具有良好的抗AS作用；且實(shí)驗(yàn)表明β-谷甾醇能通過(guò)降低高血脂大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，以達(dá)到預(yù)防AS的效果［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，在A(yíng)S發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，單一因素并不能解釋其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理，諸多因素相互作用可能是導(dǎo)致AS發(fā)生的重要原因。根據(jù)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯在治療AS過(guò)程中，主要與PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、T-cell受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號(hào)通路等相關(guān)。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清可以抑制由脂多糖（lipoplysacch aride，LPS）刺激而激活的PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制下游炎癥因子，從而對(duì)AS有治療和降低炎癥的作用［9］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制PI3K/AKT信號(hào)能調(diào)節(jié)小鼠血壓、脂肪蓄積及體內(nèi)脂質(zhì)代謝。T細(xì)胞在炎癥中的作用主要是通過(guò)對(duì)動(dòng)脈斑塊抗原適應(yīng)性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，由此產(chǎn)生大量IL-1、IL-2、IL-6及TNF-α等促炎細(xì)胞和相關(guān)因子會(huì)加速免疫炎癥反應(yīng)，最終促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展［10］。研究發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療高脂飼料誘導(dǎo)SD大鼠AS模型中，補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗AS的作用機(jī)制主要是通過(guò)下調(diào)VCAM-1mRNA表達(dá)來(lái)延緩小鼠發(fā)生AS的進(jìn)程；同時(shí)該研究通過(guò)對(duì)比補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與川芎嗪組的治療效果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯在高劑量治療和低劑量預(yù)防抗AS上有更好的療效，原因可能是通過(guò)降低IL-6、IL-8及高敏C反應(yīng)蛋白水平等來(lái)實(shí)現(xiàn)［11］。

Th17細(xì)胞主要分泌一種前炎性效應(yīng)因子，即IL-17，IL-17可以通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子、MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而加速AS的轉(zhuǎn)變［12］。另有研究表明，Th17/IL-17在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部高表達(dá)，且斑塊大小及總膽固醇水平隨著Th17細(xì)胞數(shù)量的增加而增長(zhǎng)，證實(shí)Th17/IL-17不僅參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的局部反應(yīng)，還促進(jìn)了斑塊的形成［13］。因此，我們推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-17信號(hào)通路促進(jìn)AS的治愈。

HIF-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下，集聚的HIF-1α能夠激活VEGF和CEGFR的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促使新生血管生成，形成不穩(wěn)定斑塊。同時(shí)AS產(chǎn)生過(guò)程中的致炎因子、巨噬細(xì)胞會(huì)促使HIF-1α因子在COX-2和核轉(zhuǎn)錄因子等經(jīng)典途徑表達(dá)，從而增加其活性，加速促進(jìn)AS斑塊新生［14-15］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)AS模型小鼠后HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能參與調(diào)控HIF-1α抗AS［16］。

有研究發(fā)現(xiàn)，AS是一種血管慢性進(jìn)展性炎癥，TNF-α是其中一類(lèi)參與其發(fā)病過(guò)程的炎性因子［17］。當(dāng)人體體內(nèi)的脂質(zhì)代謝發(fā)生異常時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)由于炎癥反應(yīng)的增加而進(jìn)行變性脫落［18］，TNF-α的活性因此增加，從而通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附加劇病程的發(fā)展［19］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后，TNF-α水平明顯降低，動(dòng)脈硬化斑塊面積減小，血脂代謝紊亂改善，達(dá)到了抗AS的作用［20］。AS的形成涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)中藥能夠通過(guò)影響各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路達(dá)到延緩AS的目的?；谝陨希a(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、激活自噬來(lái)緩解AS的發(fā)生發(fā)展。

在本研究中，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確定了補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS的97個(gè)潛在靶點(diǎn)，對(duì)潛在靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯活性成分通過(guò)對(duì)HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)通路進(jìn)行多靶點(diǎn)的調(diào)控，達(dá)到免疫調(diào)控、抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展。本研究為進(jìn)一步研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療AS奠定了良好的理論基礎(chǔ)，同時(shí)，本研究?jī)H為中醫(yī)科學(xué)研究提供了初步的假設(shè)，有待系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。