水翁花不同極性提取物體外抗氧化活性實驗性研究

羅 清，戴衛(wèi)波，嚴梓林

（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山醫(yī)院，廣東 中山528400；2.廣東藥科大學，廣東 中山528400）

水翁花，別名水雍花、大蛇藥、水翁仔、水榕花等，為桃金娘科植物水翁花Cleistocalyx operculatus（Roxb.）Merr.et Perry的干燥幼嫩花蕾，具有清熱解暑、生津止渴、去濕消滯之功效［1］。我院以水翁花為主要藥物制成的中藥制劑青蓮外感袋泡茶（批準文號：粵藥制字Z20071002）具有疏風解表、清熱解毒之功效，用于外感風熱感冒、發(fā)熱頭痛、咽喉腫痛、上呼吸道炎、扁桃體炎見上述證候者，深受廣大患者喜愛。近現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)水翁花具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛［2］、抗內毒素［3-4］、降血糖［5］、抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶活性［6］、保護神經細胞氧化損傷和膜脂氧化［7］、逆轉肝癌多藥耐藥［8］、抗炎保肝［9］、誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡［10］、影響過氧化氫誘導神經細胞凋亡作用［11］等多種活性。關于水翁花體外抗氧化性的實驗研究未見報道，為了進一步研究水翁花的藥效機制，為開發(fā)以水翁花為基礎的復方中藥制劑提供重要依據(jù)，本研究對水翁花不同極性提取物的體外抗氧化性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 電子分析天平（型號：BS-224S；廠家：北京SARTORIUS）、超聲波清洗器（型號：KQ5200E；廠家：昆山超聲儀器有限公司）、分光光度計（型號：UV-2550；廠家：島津SHIMADZU）、直熱式電熱恒溫干燥箱（型號：東方-A；廠家：廣州東方電熱干燥設備廠）、高速多功能粉碎機（型號：JP-300A；廠家：永康市久品工貿有限公司）

1.1.2 藥材與試劑 水翁花（廣州康圣藥業(yè)有限公司提供，批號：20180808）、95%乙醇（廣州化學試劑廠，批號：20190802）、無水乙醇（廣東西隴科學股份有限公司，批號：1708011）、DPPH（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：BFQNI-SL）、維生素C（美國Amresco公司，批號：2626C211）。

1.2 實驗方法

1.2.1 水翁花提取物粉末的制備

1.2.1 .1 水翁花乙醇提取液的制備 準確稱取水翁花藥材200 g，粉碎，于蒸餾燒瓶中，用95%乙醇1000 mL水浴回流提取2次，每次1.5 h。合并濾液，過濾，回收乙醇并濃縮，殘渣加水用超聲提取法提取5 h，提取液濃縮后得到水翁花總醇提取液共50 mL（1 mL相當于原藥材4 g）。

1.2.1 .2 水翁花總醇提液不同極性溶劑的萃取 取水翁花總醇提液50 mL于水浴鍋中蒸干，殘渣用少量蒸餾水超聲溶解，定容至30 mL，平均分成3份，每份10 mL于分液漏斗中，分別用1∶1石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行多次萃取，直至萃取液為無色。分別合并各萃取液保存?zhèn)溆?，各溶劑萃取后剩余的水層溶液合并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 .3 提取物粉末的制備 將上述各萃取液分別減壓揮干，殘渣用95%乙醇溶解，50 mL試管中離心分離后于水浴鍋中揮去乙醇至無醇味，水層液于水浴鍋中直接濃縮揮干，各殘渣于50℃烘箱中干燥至恒重并稱重，得到水翁花石油醚層粉末（A）、乙酸乙酯層粉末（B）、正丁醇層粉末（C）和水層液粉末（D）質量分別為0.472 g、3.414 g、1.074 g、0.112 g。

1.2.1 .4 DPPH乙醇溶液的制備 準確稱取DPPH粉末4 mg于燒杯中，加少量無水乙醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用無水乙醇洗滌燒杯3次，將洗滌液轉入容量瓶中，加無水乙醇至刻度線，搖勻，配成濃度為0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液（注：此溶液為現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2.2 抗氧化活性的測定

1.2.2 .1 石油醚提取物抗氧化活性的測定 （1）石油醚提取物抗氧化活性預測定：準確稱取粉末A100 mg于燒杯中，先用少量95%乙醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，燒杯用95%乙醇洗滌3次，將洗滌液一并轉入容量瓶中，加95%乙醇至100 mL，搖勻，配成1 mg/mL的母液。再把母液分別稀釋成0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的子溶液。分別取上述各濃度的子溶液5 mL與0.04 mg/mL的DPPH溶液5 mL混合，37℃避光孵化30 min，觀察顏色變化，判斷其清除率的范圍。通過預測定選取濃度為0.03、0.025、0.02、0.015、0.01 mg/mL的子溶液測定其吸光度。（2）石油醚提取物抗氧化活性的測定：DPPH抗氧化活性測定采用Wang Dacheng等［12-13］方法，并稍作調整。取離心管3支，分別加入0.03 mg/mL子溶液和0.04 mg/mL的DPPH溶液各5 mL，混合搖勻，37℃避光靜置孵化30 min。同時用該濃度溶液5 mL與5 mL的無水乙醇混合液進行空白調零，測定波長為517 nm的吸光度，取3支管吸光度的平均值，記為A樣品。按此方法，測定其余各濃度子溶液和濃度為0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。另取0.004 mg/mLDPPH溶液與95%乙醇各5 mL混勻，用無水乙醇進行空白調零，測定波長517 nm下的吸光度，重復3次，取平均值，記為ADPPH。清除率（%）=［1-A樣品/ADPPH］×100%，以萃取液濃度為橫坐標，DPPH自由基清除率為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，水翁花石油醚萃取液在濃度0～0.030 mg/mL范圍，線性關系為y=26.669x+0.0219，線性關系良好（r2=0.9964），IC50=0.0179 mg/mL。

1.2.2 .2 其余萃取物抗氧化活性測定 取100 mg粉末B、C和D按母液和子液配制方法分別配成相同濃度的母液和子液，并按上述抗氧化活性預測定方法選取濃度，其中乙酸乙酯、正丁醇萃取液選取0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL的子溶液測定其吸光度，水層液選0.035、0.030、0.025、0.020、0.015 mg/mL的溶液測定其吸光度。DPPH抗氧化活性測定具體方法參照“1.2.2.1”測定各子溶液濃度與0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。以濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，繪制標準曲線。結果水翁花乙酸乙酯萃取液在濃度0～0.05 mg/mL范圍，線性關系為y=18.082x+0.0264，線性關系良好（r2=0.9943），IC50=0.0262mg/mL。正丁醇萃取液在濃度0～0.030 mg/mL范圍，線性關系為y=26.53x+0.0069，線性關系良好（r2=0.9942），IC50=0.0186 mg/mL。水層液在濃度0～0.035 mg/mL范圍，線性關系為y=22.089x+0.0314，線性關系良好，（r2=0.9925），IC50=0.0212 mg/mL。

1.2.2 .3 維生素C抗氧化活性的測定 取10 mg維生素C，按“1.2.2.1”配制方法配成0.1 mg/mL維生素C乙醇溶液母液。再把母液稀釋成0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.002 mg/mL的維生素C乙醇子溶液。并按“1.2.2.1”預測定，選取0.007、0.006、0.005、0.004、0.003 mg/mL的溶液測定其吸光度。參照“1.2.2.1”項，石油醚抗氧化性測定各濃度與0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。結果維生素C乙醇溶液在濃度0～0.007 mg/mL范圍，線性關系為y=108.14x+0.0185，線性關系良好（r2=0.9948），IC50=0.004453 mg/mL。

2 結果

2.1 水翁花不同極性提取物的DPPH自由基清除率

水翁花不同極性提取物都具有一定的自由基清除率，且隨濃度升高，自由基清除率越強。在濃度相同時（以0.03 mg/mL為例），石油醚提取物的自由基清除率最強，為79.6853%，其次為正丁醇提取物（77.4854%），水層次之（70.5046%），乙酸乙酯提取物最弱（58.3502%），這與各提取物的IC50（圖1）結果相一致，表明水翁花不同極性提取物的自由基清除率在濃度相同時以石油醚提取物最高，其次為正丁醇提取物，水層再次之，乙酸乙酯提取物最弱。結果見表1。

表1 水翁花不同極性萃取物的DPPH自由基清除率

2.2 不同極性溶液DPPH自由基清除率比較

水翁花石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水層液自由基清除率的IC50分別為0.0179 mg/mL，0.0262 mg/mL，0.0186 mg/mL，0.0212 mg/mL，表明水翁花不同極性提取物都具有不同程度的抗氧化活性，其中石油醚萃取物的IC50最小，抗氧化性最強，正丁醇次之，乙酸乙酯萃取液最弱，但均稍弱于維生素C（IC50為0.004 453 mg/mL）。結果見圖1。

圖1 不同極性提取溶液DPPH自由基清除率對比圖

3 討論

自由基是人體內各種生化反應的中間代謝產物，其異常累積使得機體發(fā)生氧化損傷，進而引發(fā)疾病，如肝癌、肝纖維化、阿爾茨海默病、糖尿病及心血管等疾病［14］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，很多含黃酮類、多糖、維生素族、皂苷、生物堿等成分的清熱解毒類的中藥如黃芪［15］、柴胡［16］、丹參［17］等中藥及其提取物均可通過清除自由基發(fā)揮抗氧化作用，是天然抗氧化劑的主要來源。天然抗氧化劑能有效延緩衰老和治療衰老所引起的疾病，在我國逐步邁入老齡化社會的今天，尋找天然抗氧化劑來源也將成為今后的重點研究方向。

水翁花作為廣東地產藥材，具有清熱解暑、生津止渴、去濕消滯之功效，夏天常作為涼茶飲用。關于水翁花的研究近年來比較多，且逐漸深入，特別是水翁花中一種活性成分2′，4′-二羥基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）已被證實具有抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶活性［6］、降血糖［5］、抗炎保肝［10］、保護神經細胞活性等多種作用［7］。本課題前期研究也表明，水翁花具有抗內毒素作用［3］，可通過降低小鼠血清中一氧化氮（NO）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的含量，減少細菌內毒素所致動物死亡率，因NO是引發(fā)氧化應激損傷的關鍵因子之一，TNF-α是引發(fā)炎癥級聯(lián)反應的重要因子之一，表明水翁花抗內毒素作用與抑制機體氧化應激和炎癥水平有密切關系［4］，說明其可能與抗氧化活性有關。

本研究采用DPPH自由基清除法對水翁花不同極性提取物的體外抗氧化活性進行研究，并與維生素C作陽性對照。結果表明水翁花不同極性提取物都具有一定程度的自由基清除率，且隨濃度升高，自由基清除率越強，在同一濃度下石油醚提取物的自由基清除率最高，其次為正丁醇提取物，水層次之，乙酸乙酯提取物最弱，其自由基清除率的IC50值由低到高分別是石油醚提取物、正丁醇提取物、水層液、乙酸乙酯提取物，與自由基清除率的強弱結果相一致，表明石油醚萃取物的抗氧化性最強，正丁醇次之，乙酸乙酯萃取液最弱，但均稍弱于維生素C。這一結果從側面證明水翁花具有的多種活性都可能與其具有的抗氧化活性有關，但體內抗氧化及具體哪種成分對抗氧化起到主要作用還有待進一步研究。