雪峰蟲草寄主巨癤蝙蛾的生殖行為節(jié)律

李 幸，陳 珊，周 瓊

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410081)

昆蟲作為動(dòng)物界的最大類群，生殖行為對(duì)其種群繁衍起著至關(guān)重要的作用，生殖行為主要包括異性間的求偶、交配以及產(chǎn)卵等。地球因嚴(yán)格的公轉(zhuǎn)和自轉(zhuǎn)產(chǎn)生了準(zhǔn)確的季節(jié)交換和晝夜更替，一些非生物因素(例如溫、濕度光照等)隨之表現(xiàn)出周期性變化，自然生物的行為與生理形成了周期性節(jié)律特征，形成生物鐘(Pittendrigh, 1993; Takahishi, 1995; Saundersetal., 2002)。豆野螟Marucavitrata(Luetal., 2008)、二化螟Chilosuppressalis(Kanno, 1981)、蜀柏毒蛾P(guān)arocneriaorientaChao(張坤勝等, 2012)、玫瑰色卷蛾Choristoneurarosaceana(Delisle, 1995)和榆木蠹蛾Holcocerusvicarius(楊美紅等, 2010)等蛾類昆蟲的生殖行為均表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性。研究昆蟲的生殖行為及其節(jié)律，有利于掌握該蟲的生物學(xué)特性及種群活動(dòng)規(guī)律，為益蟲的利用和害蟲的防治提供重要理論依據(jù)。

巨癤蝙蛾EndoclitadavidiPoujade隸屬于鱗翅目Lepidoptera蝙蝠蛾科Hepialoidea，是一種蛀干性昆蟲(朱弘復(fù)等, 2004)，其幼蟲被雪峰蟲草菌Ophiocordycepsxuefengensis寄生感病后形成名貴中藥材雪峰蟲草(李綱等, 2017; 陳珊等, 2017)。通過(guò)分子生物學(xué)和真菌分類學(xué)的鑒定，證實(shí)雪峰蟲草和冬蟲夏草的親緣關(guān)系很近(Wenetal., 2013)。目前有關(guān)蟲草寄主昆蟲蝙蝠蛾的生殖行為鮮有報(bào)道(胡德具, 2015; 黃雪峰等, 2019)。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了巨癤蝙蛾的生殖行為及其節(jié)律，以期為進(jìn)一步揭示蝙蝠蛾的生殖行為機(jī)制，以及規(guī)?；斯わ曫B(yǎng)巨癤蝙蛾和培育雪峰蟲草提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和飼養(yǎng)條件

1.1.1供試蟲源：

分別于2015年6月-9月和2016年7月-9月自湖南省邵陽(yáng)市洞口縣(27°5′N/110°30′E，海拔300～600 m)采集巨癤蝙蛾幼蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.1.2飼養(yǎng)條件：

幼蟲用高8.5 cm、直徑6 cm的組培瓶里，用人工飼料(周瓊等, 2017)單頭飼養(yǎng)至化蛹。人工氣候箱(RXZ-280D-LED)溫度19～22℃，相對(duì)濕度80%±2%、無(wú)光照。羽化后按性別和日齡(從羽化到第一個(gè)光周期結(jié)束為一日齡，以此類推)分裝，選取展翅正常的健康雌、雄蛾供試。

1.2 研究方法

分別于2015年和2016年的9月至10月在實(shí)驗(yàn)室條件下(溫度25℃±1℃，相對(duì)濕度60%±5%)進(jìn)行。將羽化當(dāng)天的成蟲按雌、雄蛾各1頭或1雌2雄合籠(30 cm×30 cm×30 cm的尼龍網(wǎng)籠，40目)飼養(yǎng)觀察，合籠前雌蛾全部為處女蛾。共觀察23籠，其中10籠為1雌1雄、13籠為1雌2雄，觀察記錄其求偶行為。

1.2.1巨癤蝙蛾的求偶和交尾行為的日節(jié)律研究方法

野外調(diào)查和預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，巨癤蝙蛾成蟲僅晚上活動(dòng)，而白天不活動(dòng)。因此，夜間采用紅外攝像機(jī)(萊彩HD-A210)記錄其行為。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定拍攝時(shí)間在每日的19∶00-次日凌晨03∶00。記錄每對(duì)雌、雄蛾求偶、交尾始末的時(shí)間及次數(shù)，雌雄蛾腹部末端相接記為交尾。

1.2.2巨癤蝙蛾求偶率和交尾率隨日齡的變化規(guī)律

與1.2.1相同，記錄籠中求偶雄蛾數(shù)量，并計(jì)算各日齡求偶雄蛾的百分率。雄蛾求偶行為以雄蛾的后足氣味刷舒展開為標(biāo)準(zhǔn)。某日齡雄蛾求偶率(%)=(當(dāng)日齡求偶雄蛾數(shù)/當(dāng)日齡雄蛾總數(shù))×100。

1.2.3巨癤蝙蛾的產(chǎn)卵行為

與1.2.1同時(shí)進(jìn)行。每個(gè)養(yǎng)蟲籠下的白色瓷盤鋪有潮濕濾紙，以收集雌蛾產(chǎn)下的卵。記錄卵量，直至雌蛾死亡。

1.2.4產(chǎn)卵的日節(jié)律性

同上，每天分4個(gè)時(shí)間段(8∶00-12∶00、12∶00-18∶00、18∶00-23∶00、23∶00-次日8∶00)收集蟲卵。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯氏新復(fù)極差多重比較，分析各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨癤蝙蛾求偶和交尾行為節(jié)律

巨癤蝙蛾的求偶行為僅發(fā)生在暗期，雄蛾振翅、并展開氣味刷，一旦雌、雄蛾腹部末端相接觸，即可進(jìn)行交尾。交尾結(jié)束后，雄蛾爬離，雌蛾開始產(chǎn)卵。雌蛾不交尾也可產(chǎn)卵。

2.1.1巨癤蝙蛾的求偶和交尾行為的日節(jié)律

晚上室內(nèi)一關(guān)燈進(jìn)入黑暗環(huán)境，巨癤蝙蛾即很快由靜息狀態(tài)進(jìn)入求偶前期的活動(dòng)狀態(tài)，時(shí)間間隔≤5 min。求偶和交尾行為主要發(fā)生在進(jìn)入暗期的40 min內(nèi)(圖1)，可以看出，求偶行為發(fā)生的頻次最高是在進(jìn)入暗期的5～10 min內(nèi)(包括求偶過(guò)程中雌、雄蛾的多次掉落)。交尾行為主要發(fā)生在進(jìn)入暗期的10～25 min。

圖1 暗期不同時(shí)段巨癤蝙蛾的求偶和交尾行為頻次

視頻的觀察分析發(fā)現(xiàn)，雌蛾可以多次交尾，但大多數(shù)(約70.00%)每晚只交尾一次(圖2-A)，而且巨癤蝙蛾的交尾時(shí)間短暫，一般1 s到71 s不等，平均交尾時(shí)長(zhǎng)為10.11 s。其中，交尾時(shí)長(zhǎng)1～5 s的占73.34%(圖2-B)。一晚有多次交尾時(shí)，交尾間隔時(shí)間在1～36 s不等，平均約13.64 s，僅觀察到一例是雌雄蛾均掉落重新爬上籠頂再求偶交尾，間隔時(shí)長(zhǎng)達(dá)420 s。

圖2 巨癤蝙蛾不同交尾次數(shù)和時(shí)長(zhǎng)所占比例

2.1.2巨癤蝙蛾求偶率和交尾率隨日齡的變化規(guī)律

求偶行為隨日齡的變化規(guī)律見圖3。可以看出，1日齡雄性巨癤蝙蛾一進(jìn)入暗期即表現(xiàn)求偶行為，且日求偶率在2～3日齡達(dá)到高峰，2日齡求偶率可達(dá)87.33%，隨后求偶率隨日齡的增加逐漸降低，7日齡后的雄蛾極少見求偶行為，在所研究的36頭雄蛾中，僅觀察到1頭在8日齡仍有求偶行為，但并未與雌蛾交尾。

交尾行為隨日齡的變化規(guī)律：在養(yǎng)蟲籠內(nèi)，巨癤蝙蛾的成蟲羽化當(dāng)日(1日齡)即可交尾，但交尾率較低，僅為25.82%，2日齡雌蟲的交尾率達(dá)到最大值，為61.09%，此后交尾率會(huì)逐漸降低(圖3)，6日齡之后的雌蟲未觀察到交尾行為，交尾平均值為39.41%。

圖3 不同日齡巨癤蝙蛾的求偶率和交尾率

2.2 巨癤蝙蛾的產(chǎn)卵行為及其節(jié)律

2.2.1巨癤蝙蛾的產(chǎn)卵行為

巨癤蝙蛾雌蟲剛羽化時(shí)即可排卵。據(jù)室內(nèi)觀察，成蟲產(chǎn)卵分?jǐn)?shù)次進(jìn)行，產(chǎn)卵呈噴射狀，卵粒散落，無(wú)黏著性。產(chǎn)卵時(shí)，雌蟲攀附在籠內(nèi)，雙翅靜止或輕微的振動(dòng)，腹部末端產(chǎn)卵孔有節(jié)奏的收縮和舒張，將卵一粒粒連續(xù)噴射出來(lái)，產(chǎn)出的卵漸漸聚集成小丘狀(圖4)。雌蛾在一處產(chǎn)卵較多時(shí)，就會(huì)攀爬或飛到另一處繼續(xù)產(chǎn)卵。

圖4 正在產(chǎn)卵的雌性巨癤蝙蛾

巨癤蝙蛾的繁殖力強(qiáng)，平均產(chǎn)卵量約為4 250粒/雌，最少約2 500粒/雌，最高可達(dá)到約10 000粒/雌。對(duì)其中16頭雌蛾日產(chǎn)卵量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5，可以看出產(chǎn)卵量在羽化第二天(2日齡)時(shí)達(dá)到高峰979粒，隨后逐日遞減。巨癤蝙蛾的產(chǎn)卵行為通常持續(xù)到雌蟲死亡，大多雌蛾死后腹內(nèi)仍有少量遺腹卵。

圖5 巨癤蝙蛾日產(chǎn)卵量隨日齡的變化情況

2.2.2產(chǎn)卵的日節(jié)律性

巨癤蝙蛾單次產(chǎn)卵上百粒，一天內(nèi)可多次產(chǎn)卵，表現(xiàn)出明顯的日節(jié)律性。每天分4個(gè)時(shí)間段連續(xù)對(duì)其產(chǎn)卵量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)巨癤蝙蛾產(chǎn)卵時(shí)間主要發(fā)生在夜間23∶00到翌日上午8∶00，卵量與其他時(shí)間段相比差異顯著(P<0.05)(圖6-A)，上午時(shí)間和午后偶見產(chǎn)卵；其中19頭雌蟲共計(jì)連續(xù)統(tǒng)計(jì)到151次產(chǎn)卵，其中有134次發(fā)生在22∶00-次日8∶00時(shí)，占總產(chǎn)卵頻次的88.74%(圖6-B)。

圖6 巨癤蝙蛾的產(chǎn)卵行為日節(jié)律

3 結(jié)論與討論

昆蟲求偶和交配行為的發(fā)生主要由內(nèi)在生理因素決定，但不同種類昆蟲長(zhǎng)期在不同的環(huán)境下，求偶和交配的時(shí)間、高峰存在差異，這也是同域物種產(chǎn)生生殖隔離的一個(gè)重要機(jī)制(Jennions and Petrie, 1997; Gavrilets, 2000)。昆蟲的求偶是一種自發(fā)行為，表現(xiàn)為兩性之間的相互吸引，是昆蟲完成交配行為的必要環(huán)節(jié)，對(duì)昆蟲繁衍不息起著舉足輕重的作用。鱗翅目昆蟲的求偶交配都有一定的時(shí)辰節(jié)律，僅出現(xiàn)在某一特定時(shí)段(張坤勝等, 2012)，如松異舟蛾Thaumetopoeapityocampa求偶高峰期為暗期的6.4 h(Zhang and Paiva, 1998)、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner求偶高峰期為暗期的6.5 h(董雙林和杜家緯, 2002)、印度谷螟Plodiainterpunctella高峰期為暗期2 h(Nordlund and Eugene, 1974)、豆野螟求偶高峰期為暗期的5 h(陸鵬飛等, 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)，自然網(wǎng)室環(huán)境下，巨癤蝙蛾通常傍晚開始求偶、交配活動(dòng)，18∶30-19∶00為活動(dòng)高峰期；同時(shí)，室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，22∶00-23∶00熄燈后5 min內(nèi)即可以觀察到巨癤蝙蛾開始求偶活動(dòng)，而有燈光則一直不動(dòng)，說(shuō)明黑暗條件可能是觸發(fā)該蟲求偶、交尾行為的重要誘發(fā)因素。昆蟲性行為的日節(jié)律受內(nèi)源性的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)(Giebultowicz, 2000)，隨著對(duì)昆蟲晝夜節(jié)律機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，Cry基因可構(gòu)建新型的昆蟲生物鐘機(jī)制(Yuanetal., 2007)，晝夜節(jié)律時(shí)鐘基因可在神經(jīng)系統(tǒng)外的其他組織中表達(dá)，意味著晝夜節(jié)律時(shí)鐘不是傳統(tǒng)上認(rèn)為的由一個(gè)中樞主時(shí)鐘實(shí)現(xiàn)的(Giebultowicz, 1999)，晝夜節(jié)律是生物體對(duì)環(huán)境周期的適應(yīng)，所經(jīng)歷的環(huán)境條件對(duì)其行為周期性起著至關(guān)重要作用(Castrovill and Carde, 1979)。

Yangetal.(2020)研究認(rèn)為夜行性昆蟲在黃昏或夜間活動(dòng)，視覺受光線限制，遠(yuǎn)距離上利用嗅覺分辨寄主植物，在短距離上比起顏色主要依靠亮度進(jìn)行覓食和產(chǎn)卵(Yangetal., 2020)。不同蛾類交配高峰的時(shí)間有差異，筍秀夜蛾Apameaapameoides交配高峰發(fā)生在暗間4.5～6 h(葉碧歡等, 2014)；榆木蠹蛾交尾高峰出現(xiàn)在23∶00左右，光期未見交尾(楊美紅等, 2010)；豆野螟交尾高峰期在暗期5 h(Luetal., 2008)；毛健夜蛾Brithyscrini具有兩個(gè)交配高峰，分別在晚上19∶00-20∶00和凌晨00∶00-01∶00(涂小云等, 2012)，而巨癤蝙蛾的交配行為高峰發(fā)生進(jìn)入暗期的10～25 min內(nèi)。蛾類昆蟲的求偶交配只在暗期進(jìn)行，與一天中其他時(shí)間活躍的生物區(qū)分開，能有效避免天敵的危害，增加種群的存活率(薛羿等, 2017)。本研究觀察到巨癤蝙蛾的交尾時(shí)長(zhǎng)平均約10.11 s，這與胡德具(2015)報(bào)道的癤蝙蛾P(guān)hassusnodusChu交配時(shí)間短暫相一致，但與貢嘎蝠蛾Hepialusgonggaensis交尾時(shí)長(zhǎng)平均42 min(黃天福等, 1992)、蒲氏鉤蝠蛾Thitarodespui交尾時(shí)長(zhǎng)平均150 min(劉昕等, 2017)相距較遠(yuǎn)。周祖琳(1989)的研究發(fā)現(xiàn)麥蛾Sitotrogacerealella交配時(shí)長(zhǎng)一般150 min，需要達(dá)到30 min以上時(shí)精包才能進(jìn)入雌蛾體內(nèi)；并認(rèn)為，雌蛾體內(nèi)的精包數(shù)是麥蛾類是否成功授精的標(biāo)志，也是交配幾次的判斷依據(jù)。本研究主要觀察分析了巨癤蝙蛾的生殖行為節(jié)律，但在這數(shù)十秒的交尾時(shí)間里巨癤蝙蛾是否成功授精尚不清楚，相關(guān)工作尚有待進(jìn)一步的研究明確。另外，巨癤蝙蛾求偶過(guò)程中，常出現(xiàn)雄蟲或雌雄均掉落的現(xiàn)象，以及求偶成功率低(39.41%)，很可能是限制巨癤蝙蛾種群繁衍的重要因素之一。

蛾類的求偶和交尾行為受日齡的影響(Delisle, 1995)，與其性成熟程度有關(guān)。巨癤蝙蛾在羽化當(dāng)天就有求偶和交尾行為，2日齡的求偶率和交尾率最高。榆木蠹蛾(楊美紅等, 2010)、蜀柏毒蛾(張坤勝等, 2012)、雜食卷葉蛾P(guān)latynotastultana(Webster and Carde, 1982)，羽化當(dāng)天即可交尾，雌蛾在2日齡時(shí)性信息素含量最高，均表現(xiàn)出2日齡雌蛾交尾率最高。交尾成功率的高低依賴于性信息素的釋放及對(duì)信息素的感受，兩者能否協(xié)調(diào)一致(陸鵬飛等, 2007)。

不同日齡的巨癤蝙蛾產(chǎn)卵量明顯不同，羽化當(dāng)天即可產(chǎn)卵，2日齡產(chǎn)卵量最高。在一天中的不同時(shí)段，以夜間11點(diǎn)至次日8點(diǎn)的產(chǎn)卵量最多，表現(xiàn)為多次產(chǎn)卵、以及單次產(chǎn)卵量多等特點(diǎn)，這與癤蝙蛾(胡德具, 2015)的產(chǎn)卵行為極相似。巨癤蝙蛾一般2～3年一代，其中，幼蟲期約一年半(未發(fā)表數(shù)據(jù))，長(zhǎng)時(shí)間的取食生活，使幼蟲體內(nèi)積蓄充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保證了成蟲羽化前生殖器官的發(fā)育成熟，羽化時(shí)即可進(jìn)行生殖行為，繁殖后代。雌蟲產(chǎn)卵量大，平均約為4 250粒/雌，最高可達(dá)到約10 000粒/雌，相比于其它成蟲期需要飼喂補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的蛾類，如榆木蠹蛾雌蛾最高產(chǎn)卵量720粒/雌(楊美紅等, 2010)，蜀柏毒蛾雌蛾最高產(chǎn)卵量402粒/雌(張坤勝等, 2012)，亞洲型舞毒蛾Lymantriadisparasiatica雌蛾最高產(chǎn)卵量357粒/雌(薛羿等, 2017)，巨癤蝙蛾繁殖力強(qiáng)大。巨癤蝙蛾羽化第二天產(chǎn)卵量最大，可能是一種自我保護(hù)和適應(yīng)策略，因?yàn)槠湔麄€(gè)成蟲期不攝食，在羽化早期體內(nèi)蓄積能量充足，能盡量多產(chǎn)卵以充分繁殖后代。最后死亡的雌蛾體內(nèi)通常還有遺腹卵，說(shuō)明其生命后期可能已無(wú)足夠的能量供其產(chǎn)出所有的卵。同時(shí)，該蟲僅在暗期繁殖行為(包括求偶、交尾、產(chǎn)卵)時(shí)活動(dòng)，完成后又進(jìn)入懸掛的靜息狀態(tài)，這樣可以減少能量的消耗，以保證有足夠的能量完成其強(qiáng)大繁殖能力的產(chǎn)卵行為。巨癤蝙蛾的卵散產(chǎn)，與雌蛾內(nèi)生殖系統(tǒng)缺少粘液腺器官(未發(fā)表數(shù)據(jù))密切相關(guān)，這與玉龍蝠蛾HepialusyulongensisLiang(趙萬(wàn)源等, 1989)相似。巨癤蝙蛾的繁殖能力強(qiáng)，整個(gè)成蟲期少活動(dòng)、不取食，卵散產(chǎn)和經(jīng)常更換產(chǎn)卵位置等，既可以減少成蟲被天敵發(fā)現(xiàn)，又可以有效防止所產(chǎn)的卵被天敵一次性捕食或寄生，提高后代的存活率，這些因素很可能是蝙蝠蛾科作為鱗翅目昆蟲最原始的類群，能適應(yīng)環(huán)境生存繁衍至今的重要原因。

巨癤蝙蛾生殖行為發(fā)生在暗期，黑暗條件可能是其進(jìn)入生殖行為的誘因，羽化當(dāng)天晚上即可進(jìn)行求偶、交尾和產(chǎn)卵，交尾時(shí)間短暫。在第二天其求偶率、交尾率、產(chǎn)卵量達(dá)到最高，之后隨著日齡的增加而逐漸降低。巨癤蝙蛾產(chǎn)卵量大的特點(diǎn)可為人工規(guī)?；曫B(yǎng)巨癤蝙蛾及培育雪峰蟲草提供有利條件。

致謝：承蒙2014級(jí)碩士生李綱參與部分研究，在此表示衷心的感謝！