染料木素脂質(zhì)體的制備及其包封率和穩(wěn)定性研究*

謝 琳，韋龍華，蔣雯麗，熊建文，易 慧，蔡錦源，崔 娜

柳州工學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545616

染料木素（GEN）屬于黃酮類化合物，化學(xué)名稱為4',5,7-三羥基異黃酮（C15H10O5），是主要從染料木、山豆根、大豆、槐角、大葉千金拔等植物提取出來的一種異類黃酮類化合物。染料木素幾乎不溶于水，溶于稀堿、乙醇等有機(jī)溶劑中。因其具有與雌性激素相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出雌激素樣活性和作用，故又稱為植物雌激素[1]。雌性激素刺激膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成是其緩解皮膚老化、改善皺紋的主要機(jī)制[2]。此外還具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多種藥理活性。染料木素的天然資源富足，在大多數(shù)動物種類中表現(xiàn)出極低水平的毒性作用，被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品與保健藥用等領(lǐng)域[3]。染料木素是脂溶性藥物，它的口服試劑和注射試劑藥物利用率極低，如何提高藥物利用及其溶解度等內(nèi)容已成為當(dāng)今藥劑工作者們研究的熱門課題，但目前還沒有完善的關(guān)于染料木素脂質(zhì)體制備的研究。

化妝品中的功能性成分必須透過角質(zhì)層達(dá)到相應(yīng)的作用部位，才能起到營養(yǎng)、改善皮膚狀況的作用，而人的皮膚的角質(zhì)層具有極強(qiáng)的屏障作用，大分子的功能性成分難以通透。將功能性成分裝進(jìn)脂質(zhì)體囊泡中，由于脂質(zhì)體與生物膜結(jié)構(gòu)相似，功能性成分在脂質(zhì)體的攜帶下經(jīng)皮透過量增加。脂質(zhì)體是將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層的超微型球狀載體。脂質(zhì)體由磷脂和膽固醇組成，可使脂溶性藥物易分散于水中，脂溶性藥物被脂質(zhì)體包封后的構(gòu)成具有靶向性、緩釋性和穩(wěn)定性，且毒性低的新型藥物劑型[4-7]。自從脂質(zhì)體應(yīng)用于化妝品后，人們就開始探究它對于皮膚的效用。經(jīng)實驗分析，它確實對肌膚具有效用，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：提高功能性藥物的穩(wěn)定性；使功能性藥物留在表皮與真皮之間，提高藥物利用率；保護(hù)肌膚的作用；對肌膚具有良好的保濕效果。目前制備脂質(zhì)體的方法主要有乙醇注入法、逆向蒸發(fā)法、薄膜超聲分散法、超臨界CO2等[8]。文章采用薄膜超聲分散法制備染料木素脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的配方組成會影響脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，從而影響包封率，因此文章通過正交設(shè)計優(yōu)化染料木素脂質(zhì)體的配方，為染料木素脂質(zhì)體在化妝品、食品、藥品中的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 試劑與儀器

試劑：卵磷脂、膽固醇（河南天興食品添加劑，食品級）；染料木素（中國食品藥品檢定研究所,純度＞98%）；“吐溫-80”（天津中和盛泰化工有限公司，食品級）；三氯甲烷、甲醇、鹽酸（西隴科學(xué)股份有限公司，AR級）。

儀器：JJ200電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；TDZ4-WS臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；UV-1800紫外分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；Nikon Eclipse E200光學(xué)顯微鏡（上海衡浩儀器有限公司）。

2 試驗方法

2.1 染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取染料木素1.6mg，放置于100mL容量瓶中用無水乙醇溶解并定容至刻度，得到染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液（16μg/mL），精確吸取1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL溶液并放置于10mL試管中，并用無水乙醇將體積調(diào)節(jié)至刻度，以無水乙醇作空白對照，在263nm處測取吸光度，以吸光度與標(biāo)準(zhǔn)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.2 染料木素脂質(zhì)體的制備

（1）溶劑及緩沖液制備：取70g甲醇于250mL燒杯中加入30g三氯甲烷，攪拌均勻，放置于棕色瓶中保存做溶劑。取30.285g Tris于250mL錐形瓶中加入200mL純水，再加20mL濃鹽酸，高溫高壓殺菌后，常溫保存，控制pH值約在7.20，做緩沖液。

（2）染料木素的制備：按劑量比稱取染料木素、大豆卵磷脂、膽固醇和“吐溫-80”放置于燒瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（3∶7）混合溶劑溶解，在一定溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑（控制壓力在0.06MPa），直至燒瓶內(nèi)壁形成一層干燥的薄層脂膜，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min使脂膜完全干燥（控制壓力在0.10MPa），加入超過量三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl（pH值為 7.20）生物緩沖液（控制壓力在0.02MPa）。繼續(xù)減壓蒸餾10min，超聲波冰水浴10min（控制溫度在10℃），重復(fù)3次，至體系均勻分散。

2.3 包封率的計算

總含量測定：取1mL脂質(zhì)體于10mL試管中用無水乙醇定容至10mL進(jìn)行破乳，取1mL破乳液稀釋至10mL，用紫外分光光度計于263nm處測定吸光度。

游離染料木素測定：取2mL脂質(zhì)體放置于離心管中，在3000r/min下離心30min，取上清液0.1mL于10mL試管中并定容至10mL刻度，用紫外分光光度計于263nm處測定吸光度。

計算方法：包覆率=（產(chǎn)品中染料木素總含量-液體介質(zhì)中游離的染料木素含量）÷產(chǎn)品中染料木素總含量。

2.4 單因素實驗

（1）溫度對包覆率的影響。加入0.8g大豆卵磷脂、0.4g染料木素、0.20g膽固醇、5mL溶劑、0.10g“吐溫-80”，改變溫度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），按2.3節(jié)制備并測定脂質(zhì)體包封率。

（2）染料木素對脂質(zhì)體的影響。加入0.80g大豆卵磷脂、0.20g膽固醇、5mL溶劑、0.10g“吐溫-80”、30℃，僅改變?nèi)玖夏舅睾?，分別使大豆卵磷脂∶染料木素質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，按2.3節(jié)方法制備并測定脂質(zhì)體包封率。

（3）膽固醇對脂質(zhì)體的影響。加入0.80g大豆卵磷脂、0.40g染料木素、5mL溶劑、0.10g“吐溫-80”、30℃，僅改變膽固醇含量，分別使大豆卵磷脂:膽固醇為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，按第2.3節(jié)的方法制備并測定脂質(zhì)體包封率。

（4）表面活性劑對脂質(zhì)體的影響。加入0.8g大豆卵磷脂、0.4g染料木素、0.20g膽固醇、5mL溶劑、30℃，僅改變表面活性劑含量，使大豆卵磷脂∶表面活性劑質(zhì)量比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、8∶1，按2.3方法制備并測定脂質(zhì)體包封率。

2.5 正交試驗

A表示大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比，B表示大豆卵磷脂與染料木素質(zhì)量比，C表示大豆卵磷脂與“吐溫-80”質(zhì)量比。采用L9(34)正交試驗表進(jìn)行正交試驗，如表1所示。

2.6 顯微鏡觀察

取適量的染料木素脂質(zhì)體稀釋20倍，用吸管吸取，滴一滴于載玻片上，并用蓋玻片蓋住，用濾紙吸取多余水分置于顯微鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)。

2.7 染料木素脂質(zhì)體穩(wěn)定性研究

（1）染料木素脂質(zhì)體熱穩(wěn)定性測試。取染料木素脂質(zhì)體，分為三組，放置于10mL試管中于4℃下3h，25℃下3h，37℃下3h和65℃下15min保存，并用紫外分光光度計測定吸光度。

（2）染料木素脂質(zhì)體水解和貯存。制備三批脂質(zhì)體，每批分為三組，于4℃各放一組避光保存，于1d、2d、3d、4d、5d測定pH值。取脂質(zhì)體放置于4℃下，在4d內(nèi)觀察包封率。

（3）染料木素脂質(zhì)體氧化測試。制備0.25mol/L鹽酸200mL，加入硫代巴比妥酸0.75g，三氯乙酸30g，溶解并過濾取濾液，得到TTH試劑。取三批脂質(zhì)體，每批分為三組，于4℃避光保存1d、2d、3d、4d、5d，各取1mL于10mL離心管中，加5mL TTH試劑，混勻，100℃水浴30min，冷卻后加TTH試劑定容，混勻，3000r/min離心5min，以TTH試劑為空白對照，取上清液在535nm處測定吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線

染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素實驗

（1）溫度對脂質(zhì)體包封率的影響如圖2所示。

圖2 溫度對脂質(zhì)體包封率的影響

由圖2可知，隨著溫度的增加，包封率先增大后減小，最后居于平緩，在30℃達(dá)到最高。體系隨著溫度的升高，會導(dǎo)致大豆卵磷脂發(fā)生水解而使包封物滲漏，使得包封率降低，考慮到經(jīng)濟(jì)性及產(chǎn)率，選擇30℃作為制備脂質(zhì)體的溫度。

（2）染料木素添加量對脂質(zhì)體包封率的影響如圖3所示。

圖3 染料木素添加量對脂質(zhì)體包封率的影響

實驗中，大豆卵磷脂與染料木素比例分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及5∶1，測定其包封率。結(jié)果表明，隨著染料木素添加量減少，包封率先增加后降低。當(dāng)質(zhì)量比為5∶1時，得到的包封率最低，且加入染料木素的量較少，脂質(zhì)體中含有的量也較少，還浪費(fèi)了大量的大豆卵磷脂和膽固醇壁材。當(dāng)大豆卵磷脂與染料木素的質(zhì)量比為3∶1時得到的包封率較高，且為93.11%。因此，選取1∶1、2∶1、3∶1作為正交試驗的三水平。

（3）膽固醇對脂質(zhì)體包封率的影響如圖4所示。

圖4 膽固醇對脂質(zhì)體包封率的影響

實驗中，大豆卵磷脂與膽固醇比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1及8∶1，測定其包封率。結(jié)果表明，隨著膽固醇添加量的減少，包封率先增加后減小。當(dāng)大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為2∶1時，脂質(zhì)體中膽固醇的含量高使其嵌入雙分子層夾層的含量就高，導(dǎo)致囊泡夾層空間縮小，染料木素進(jìn)入夾層的含量降低，因此包封率較低；而當(dāng)膽固醇的含量較低時，磷脂脂膜的流動性大，包封的藥物易于滲漏，招致脂質(zhì)體包封率低。當(dāng)大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4∶1時所得到的包封率最高，且為92.60%，因此，選取大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為3∶1、4∶1、5∶1作為正交試驗三水平。

（4）表面活性劑對脂質(zhì)體包封率的影響如圖5所示。

圖5 表面活性劑對脂質(zhì)體包封率的影響

該實驗在相同大豆卵磷脂用量、相同膽固醇用量及相同染料木素用量的條件下，考察“吐溫-80”加入量對脂質(zhì)體包封率的影響。在實驗中，大豆卵磷脂與“吐溫-80”比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1及8∶1，測定其包封率，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明隨著“吐溫-80”添加量的減少，包封率逐漸增大。因此，選取6∶1、7∶1、8∶1作為正交試驗的三水平。

3.3 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2所示。由表2可知,影響染料木素脂質(zhì)體包封率的先后次序為A＞B＞C，根據(jù)均值可以得到染料木素脂質(zhì)體的最優(yōu)制備條件為A3B3C3，即大豆卵磷脂∶染料木素為3∶1，豆卵磷脂∶膽固醇大為5∶1，大豆卵磷脂與“吐溫-80”的比例為8∶1。方差分析表如表3所示。根據(jù)表3可知，大豆卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比具有顯著性差異。

表2 正交實驗結(jié)果

表3 方差分析表

3.4 最優(yōu)驗證

包封率驗證結(jié)果如表4所示。由表4可知，在染料木素脂質(zhì)體最優(yōu)的制備條件下，三次重復(fù)實驗包封率均在94%以上，平均包封率為95.14%。由此可知，實驗重復(fù)性良好，最優(yōu)制備條件正確，所選工藝條件是可取的。

3.5 脂質(zhì)體的形態(tài)

最優(yōu)制備條件下的染料木素脂質(zhì)體形態(tài)為橢圓球形，外觀完整，符合脂質(zhì)體形態(tài)。其粒徑大多在200～300nm，屬于大單室脂質(zhì)體，少部分粒徑達(dá)到1～2μm。有專家在離體人體腹部皮膚擴(kuò)散實驗中CLSM技術(shù)發(fā)現(xiàn)粒徑超過600nm的普通脂質(zhì)體不能將內(nèi)容物傳遞到皮膚深層；而粒徑小于300nm時，可以實現(xiàn)內(nèi)容物的皮膚深層傳遞；粒徑小于70nm時，可以在表皮和真皮內(nèi)獲得最大的熒光度。由此可見制備的染料木素脂質(zhì)體可以把染料木素傳遞到皮膚深層。該制備的脂質(zhì)體可以運(yùn)用在化妝品制劑中。

3.6 染料木素脂質(zhì)體穩(wěn)定性測試結(jié)果

（1）脂質(zhì)體熱穩(wěn)定性。儲存溫度對包封率的影響如圖6所示。

圖6 儲存溫度對包封率的影響

由圖6可知，染料木素脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性隨溫度的增高而降低，在65℃時破壁效果明顯，脂質(zhì)體從95%降至75%，在常溫和消化溫度下脂質(zhì)體也具有一定的破壁效應(yīng)，只有在4℃時脂質(zhì)體破壁不明顯，因此可見脂質(zhì)體應(yīng)儲存在低溫環(huán)境下。在4℃儲存染料木素脂質(zhì)體10d，脂質(zhì)體包封率變化不大，無明顯差別，維持在95%以上。因此，脂質(zhì)體在4℃ 貯存是優(yōu)良的，此時脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好。

（2）脂質(zhì)體的水解。脂質(zhì)體膜材的水解反應(yīng)使得脂質(zhì)體中的膜材磷脂容易發(fā)生水解，脂質(zhì)體制劑酸度通過磷脂的水解而增長，因此隨著酸度的改化，脂質(zhì)體的pH值也會隨之變化[9]。儲存天數(shù)對pH值的影響如圖7所示。由圖7可知，脂質(zhì)體溶液的pH隨著時間的推移緩慢降低，表明了脂質(zhì)體正在水解，但在前面幾天脂質(zhì)體水解緩慢，pH值未發(fā)生明顯變化。因此在制備脂質(zhì)體時應(yīng)制備高濃度的脂質(zhì)體溶液，防止水解反應(yīng)產(chǎn)生，影響脂質(zhì)體包封率[10]。

圖7 儲存天數(shù)對pH值的影響

（3）脂質(zhì)體的氧化。磷脂的氧化產(chǎn)物丙二醛可以與硫代巴比妥酸反應(yīng)，在高溫下產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在535nm處有特殊吸收峰[11-13]。儲存天數(shù)與脂質(zhì)體氧化的關(guān)系如圖8所示。由圖8可知，脂質(zhì)體隨著時間的推移，氧化產(chǎn)物增加，氧化物與硫代巴比妥酸反應(yīng)呈紅色。因此在儲存染料木素脂質(zhì)體的時候應(yīng)該密封儲存，防止脂質(zhì)體過多與空氣接觸，使磷脂與氧氣反應(yīng)[14]。

圖8 儲存天數(shù)與脂質(zhì)體氧化的關(guān)系

4 結(jié)論

文章采用了薄膜分散法，將染料木素制備成脂質(zhì)體。從配方組成、穩(wěn)定性等方面研究了脂質(zhì)體，最后得出以下結(jié)論：最優(yōu)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30℃，此時大豆卵磷脂∶膽固醇為5∶1，大豆卵磷脂∶染料木素為3∶1，大豆卵磷脂∶“吐溫-80”為8∶1；在最優(yōu)的制備條件下得到的染料木素脂質(zhì)體包封率為95.14%，粒徑為200～300nm，有的高達(dá)1000nm。通過測定脂質(zhì)體穩(wěn)定性得出，制備脂質(zhì)體應(yīng)先制備高濃度的脂質(zhì)體溶液，并在4℃的溫度下儲存。