血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

柴 鈺 金翠柳 凌 望 吳美平

動脈粥樣硬化( atherosclerosis, AS)是一種以血管異常炎性反應(yīng)為主要表現(xiàn)，以脂質(zhì)沉積、斑塊形成以及內(nèi)膜增厚為主要病理特征，發(fā)生于血管內(nèi)膜及內(nèi)膜下的慢性炎癥性疾病，是心絞痛、心肌梗死、心力衰竭、腦卒中等多種心腦血管疾病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞是人體最大、最重要、功能高度活躍的器官，廣泛分布于血管腔的內(nèi)表面，其連續(xù)性和完整性是維持血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[2，3]。在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的病理過程中通常伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡是動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)，同時存在于動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的整個病理進(jìn)程[4]。

內(nèi)皮細(xì)胞生存命運及其機(jī)制一直是冠心病病理學(xué)研究熱點。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡方式包括凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡等，其中焦亡作為一種新的、獨特的細(xì)胞死亡方式引起人們越來越多的關(guān)注。目前，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他多種細(xì)胞類型中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡的存在，并且多項研究表明,細(xì)胞焦亡與動脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)。因此，深入探討內(nèi)皮細(xì)胞焦亡在動脈粥樣硬化病理進(jìn)程中的潛在作用和分子機(jī)制，可為動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的預(yù)防和治療提供新的依據(jù)及策略。

一、血管內(nèi)皮細(xì)胞之命運與動脈粥樣硬化的關(guān)系

動脈粥樣硬化是一種影響血管樹并導(dǎo)致冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)、外周動脈疾病和腦卒中的病理生理過程[5]。自1755年Albrecht von Haller提出“動脈粥樣硬化”一詞以來，人們對動脈粥樣硬化病理生理學(xué)的理解有了很大的發(fā)展?，F(xiàn)在認(rèn)識到，最終導(dǎo)致冠心病的細(xì)胞和組織級聯(lián)反應(yīng)遠(yuǎn)比內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層膽固醇顆粒的積累復(fù)雜得多。目前被普遍接受的由美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究專家ROSS提出并修正的“損傷反應(yīng)”學(xué)說認(rèn)為,內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化早期病變發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。

生理狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞大多呈梭形,其排列與血流方向一致，可通過不同類型的黏附結(jié)構(gòu)或連接方式形成連續(xù)的細(xì)胞單層，能有效隔離血液和組織液，使血管壁免受體內(nèi)外各種物理、化學(xué)因素的損傷。但當(dāng)血管內(nèi)皮受到血流的沖刷、血脂紊亂、高血糖、煙草、藥物、病原微生物等危險因素的刺激時，內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮下空間中循環(huán)脂蛋白顆粒局部滲透、捕獲和物理、化學(xué)修飾[6]。循環(huán)單核細(xì)胞從血液中選擇性招募進(jìn)入內(nèi)膜，在內(nèi)膜中它們分化成巨噬細(xì)胞并內(nèi)化修飾過的脂蛋白成為泡沫細(xì)胞[7]。泡沫細(xì)胞進(jìn)一步聚集形成脂紋，這是動脈粥樣硬化的早期病變。動脈粥樣硬化的病理變化過程可分為脂質(zhì)條紋期、纖維樣斑塊期、粥樣斑塊期及復(fù)合病變期4個期，在一個特定的個體中，多個動脈粥樣硬化斑塊可以同時存在，每個斑塊都處于其各自的病理生物進(jìn)化階段。在這一系列復(fù)雜事件中，內(nèi)皮細(xì)胞扮演著極其重要的角色，內(nèi)皮細(xì)胞功能減退乃至死亡構(gòu)成了動脈粥樣硬化致病的必要條件。

二、決定血管內(nèi)皮細(xì)胞命運的方式

“生老病死”是生命的必經(jīng)歷程，亦是自然界的基本規(guī)律。但凡有生，終有歸途。細(xì)胞死亡是細(xì)胞生命過程中的一個必經(jīng)階段，不僅對生物體的生長、發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，而且對于維持生物體的穩(wěn)態(tài)和基本生物學(xué)功能具有重要意義[8]。2009年細(xì)胞死亡學(xué)術(shù)命名委員會根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞死亡分為壞死、凋亡、鐵死亡、自噬及焦亡等[9]。

細(xì)胞壞死是一種裂解性細(xì)胞死亡，它由環(huán)境擾動觸發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞核皺縮、質(zhì)膜破裂、細(xì)胞自溶以及炎性細(xì)胞內(nèi)容物失控釋放[10]。細(xì)胞凋亡遵循細(xì)胞固有的程序性自殺機(jī)制,屬于正常的細(xì)胞周期發(fā)育。其生理特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞在不釋放胞質(zhì)內(nèi)容物到細(xì)胞外空間的情況下自動解體并有效抑制炎癥。鐵死亡是一種氧化性非凋亡性的細(xì)胞死亡形式，其病理特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物蓄積，形態(tài)特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜斷裂出泡，線粒體體積變小，膜密度增加，嵴減少或消失，線粒體外膜破裂，但細(xì)胞核大小正常且無染色質(zhì)凝聚[11]。自噬最早由著名細(xì)胞學(xué)家克里斯汀·德·迪夫提出，指膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)衰老損傷的細(xì)胞器形成自噬體,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)對細(xì)胞自身代謝需要的調(diào)控和細(xì)胞器的更新[12]。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種介于凋亡和壞死之間的炎癥性程序性細(xì)胞死亡[13～15]。作為一種新進(jìn)發(fā)現(xiàn)并被證實的細(xì)胞死亡模式，有研究證明，細(xì)胞焦亡依賴于半胱氨酸依賴性天冬氨酸特異性蛋白酶家族(caspase)而存在，且在形態(tài)、機(jī)制和病理生理上均不同于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。焦亡發(fā)生時，孔道形成，質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物和促炎性介質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，募集更多的炎性細(xì)胞進(jìn)而擴(kuò)大了炎性反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

三、細(xì)胞焦亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑：經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑是依賴于caspase-1的細(xì)胞焦亡途徑[16]。當(dāng)細(xì)菌、真菌和病毒等病原體感染宿主細(xì)胞時，pro-caspase-1通過凋亡相關(guān)斑點樣接頭蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)與特異性模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)NLR間接連接形成一個多聚體蛋白復(fù)合物炎性小體。pro-caspase-1一旦被募集到炎性小體后，它就會二聚體化并激活自身的蛋白酶活性，將無活性的caspase-1前體裂解形成有活性的caspase-1?；罨腸aspase-1一方面可以切割GSDMD使其成為GSDMD-N，后者能插入細(xì)胞膜誘導(dǎo)形成細(xì)胞膜孔道，這些孔道驅(qū)散細(xì)胞離子梯度，增加滲透壓并導(dǎo)致滲透水流入，進(jìn)而誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜裂解、細(xì)胞死亡及胞內(nèi)物質(zhì)釋放等一系列炎性反應(yīng)。另一方面，活化的caspase-1也能切割白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-18前體，將其激活成為有活性的IL-1β和IL-18，并通過GSDMD細(xì)胞膜孔道將其釋放至細(xì)胞外，招募更多炎性細(xì)胞，擴(kuò)大炎性反應(yīng)[17，18]。這種依賴caspase-1的細(xì)胞焦亡途徑就被稱為經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。其中炎性小體的形成是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑的重要特征之一。

2.非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑:人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11作為胞內(nèi)受體，在受到革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，可識別LPS并與之直接結(jié)合而介導(dǎo)炎癥壞死，這種依賴caspase-4/5/11的細(xì)胞死亡方式被稱為非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑[19]。其機(jī)制是LPS可通過與caspase-4/5/11結(jié)合而誘導(dǎo)其活化，活化的caspase-4/5/11在N末端和C末端結(jié)構(gòu)域間的接頭內(nèi)直接剪切GSDMD,從而釋放具有成孔活性的N端結(jié)構(gòu)域GSDMD-N,GSDMD-N 通過結(jié)合膜磷酸肌醇轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，在膜上穿孔進(jìn)而引起細(xì)胞焦亡[20]。此外，LPS與caspase-11特異性結(jié)合后，活化的caspase-11可促進(jìn)縫隙連接半通道蛋白Pannexin-1的激活和Pannexin-1依賴性ATP通道的開放。裂解的Pannexin-1打開自身通道以釋放ATP與細(xì)胞膜上P2X7 受體結(jié)合，打開非選擇性P2X7陽離子通道，繼而導(dǎo)致胞內(nèi)的K+外流，胞外的Na+和Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞膜完整性受損，釋放內(nèi)容物引發(fā)炎性反應(yīng)及細(xì)胞死亡[21]。雖然經(jīng)典途徑中的炎性小體也參與依賴caspase-11的細(xì)胞焦亡途徑,但是caspase-11的自身活化與細(xì)胞死亡并不依賴于PRRs和ASC。因此，炎性小體并不是介導(dǎo)非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑的必需條件。

四、血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡與動脈粥樣硬化

1.血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡是促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的新機(jī)制:有研究表明，動脈粥樣硬化病理變化過程中的多種體內(nèi)外危險因素如高血壓、高血糖、高血脂、吸煙及肥胖等均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。如Yin等[22]研究發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，可使內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP1、NLRP3、caspase-1和IL-1β表達(dá)水平均明顯升高，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。Xi等[23]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性代謝刺激物同型半胱氨酸能夠通過激活caspase-1依賴的炎性小體活化誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。另有研究報道，金屬離子(Ni2+、Hg2+等)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體活化、caspase-1激活和成熟的IL-1β產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[24]。

內(nèi)皮細(xì)胞焦亡可促進(jìn)IL-1β、IL-18、P-選擇素、細(xì)胞間黏附分子、血管細(xì)胞黏附分子等大量分泌，觸發(fā)單核-吞噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致血管壁炎性反應(yīng)的增強(qiáng)和血管內(nèi)膜完整性的破壞，進(jìn)而加劇動脈粥樣硬化病變進(jìn)程(圖1)。如高膽固醇血癥可通過NADPH氧化酶誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生從而激活NLRP3炎性小體和caspase-1，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，促進(jìn)炎性反應(yīng)，加劇動脈粥樣硬化[25]。吸煙是促使動脈粥樣硬化發(fā)生的重要危險因素之一，Wu等[26]研究發(fā)現(xiàn)尼古丁可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而激活NLRP3炎性小體，促使caspase-1成熟和IL-1β、IL-18的產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡而加劇動脈粥樣硬化。鎘元素是一種較為常見的金屬污染物，Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，其可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS，進(jìn)而活化NLRP3炎性小體及其下游的caspase-1和IL-1β，從而誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡與動脈粥樣硬化

2.基于血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡西醫(yī)治療動脈粥樣硬化的現(xiàn)狀：動脈粥樣硬化是一種危及人類健康的慢性炎癥性病變，是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要原因。鑒于其臨床與基礎(chǔ)研究的不斷深入，目前防治動脈粥樣硬化的藥物主要包括調(diào)脂類藥物、抗栓和抗凝類藥物、鈣通道阻滯劑、抗氧化類藥物等。調(diào)脂類藥物如他汀類、貝特類、煙酸類、膽酸螯合劑等主要通過降低低密度脂蛋白發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用；抗栓類藥物如阿司匹林、氯吡格雷、阿昔單抗等主要通過降低血小板的黏附和聚集防止血栓形成；抗凝類藥物如普通肝素、低分子肝素、比伐盧定等通過影響凝血過程中的某些凝血因子抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成；鈣通道阻滯劑則主要通過減少低密度脂蛋白的氧化和平滑肌細(xì)胞的增殖，增加血管內(nèi)皮舒張因子的釋放，預(yù)防和控制動脈粥樣硬化；抗氧化類藥物如普羅布考和泛硫乙胺，可通過減少細(xì)胞因子和趨化因子對細(xì)胞的刺激作用，抑制細(xì)胞凋亡和壞死，從而阻斷動脈粥樣硬化的發(fā)生。

藥物治療的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)靶點，通過靶點的抑制、激活和改變來達(dá)到阻止或逆轉(zhuǎn)病程進(jìn)展的目的。然而，雖然他汀類、貝特類和抗栓類等藥物除靶向低密度脂蛋白和血小板外，還具有抗炎的功效，但對于血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡這一新機(jī)制，目前尚無西藥對其有深入明確的研究。

3.干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡是中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化的新策略：細(xì)胞焦亡是一種伴隨炎性因子釋放并引發(fā)細(xì)胞膜破裂溶解的新型死亡方式。近年來研究發(fā)現(xiàn)，該死亡形式在感染性疾病、代謝性疾病及動脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色。目前雖然用于干預(yù)細(xì)胞焦亡的藥物種類不少，但多數(shù)還處于基礎(chǔ)研究階段，中醫(yī)藥作為經(jīng)驗醫(yī)學(xué)，其研究與西醫(yī)不同，多是在已有臨床功能效果的基礎(chǔ)下的機(jī)制研究。因此，中醫(yī)藥干預(yù)細(xì)胞焦亡的研究日益增多。洪蕾等[28]在探究很多中藥如虎杖等的有效單體白藜蘆醇對脂多糖誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞增殖、炎性因子釋放及焦亡的影響時發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過減少炎性因子的釋放，降低NLRP3、Gasdermin D、caspase-1及ELAVL1的表達(dá)，對脂多糖誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞焦亡起到一定的保護(hù)作用。景艷蕓等[29]研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花乙素可通過上調(diào)巨噬細(xì)胞中cAMP水平來激活PKA，從而抑制ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及巨噬細(xì)胞的焦亡。唐標(biāo)等[30]以缺氧、缺糖(復(fù)氧)復(fù)糖誘導(dǎo)構(gòu)建體外缺血再灌注SH-SY5Y細(xì)胞模型，探討三七總皂苷對SH-SY5Y細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可降低細(xì)胞中GSDMD、GSDMD-N及caspase-1蛋白水平，抑制IL-1β和IL-18釋放，進(jìn)而減輕缺氧缺糖(復(fù)氧)復(fù)糖誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞功能損傷。中醫(yī)藥干預(yù)細(xì)胞焦亡或已成為新的研究熱點。

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血液與血管壁之間的保護(hù)性屏障，其焦亡容易導(dǎo)致血管內(nèi)膜上脂質(zhì)沉積，促使一系列的免疫反應(yīng)導(dǎo)致白細(xì)胞沉積到血管壁，從而形成局部血栓。因此中醫(yī)藥針對血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的預(yù)防或治療亦成為研究的熱點之一。吳樹寧等[31]在探索大黃素對脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的影響時發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧水平來抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而抑制缺氧條件下細(xì)胞焦亡，減少血管內(nèi)皮損傷，防治心血管疾病。有研究采用二氫楊梅素預(yù)處理棕櫚酸誘導(dǎo)的焦亡人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性及其細(xì)胞膜完整性增強(qiáng)，LDH釋放減少，caspase-1、IL-1β和ICAM-1表達(dá)降低，內(nèi)皮細(xì)胞焦亡減少。目前，細(xì)胞焦亡作為新的死亡方式已逐漸步入人們的視線，其釋放的大量炎性物質(zhì)及參與的多種蛋白成為可能的治療靶點。中醫(yī)藥對血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的治療與西醫(yī)比較，對機(jī)體有更少的損害及不良反應(yīng)。因此，中醫(yī)藥干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡在防治動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中是一項新思路。

五、展 望

內(nèi)皮細(xì)胞焦亡作為新進(jìn)發(fā)現(xiàn)并被證實的一種伴隨炎性因子釋放的獨特的程序性細(xì)胞死亡方式，其在內(nèi)皮屏障和動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的病理進(jìn)程中起著重要作用。在動脈粥樣硬化病理進(jìn)程中，多種體內(nèi)外危險信號均可通過經(jīng)典或非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑引起血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡，促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎性因子的大量釋放，進(jìn)而可以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)增強(qiáng)，促使斑塊形成、易損和破裂。但由于研究處于開始階段，使得目前研究相關(guān)性結(jié)論多，內(nèi)皮焦亡與冠心病因果關(guān)系尚需開展深入研究予以證實。

中醫(yī)對內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的研究目前處于基礎(chǔ)階段。因此，從中醫(yī)藥角度對內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的作用及機(jī)制進(jìn)一步深入研究，發(fā)揮中醫(yī)藥的獨特優(yōu)勢，通過中醫(yī)藥調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞焦亡至陰陽平和狀態(tài)同樣必不可少。相信隨著未來研究的不斷深入，內(nèi)皮細(xì)胞焦亡在動脈粥樣硬化病理進(jìn)程中的作用將逐步闡明，而內(nèi)皮細(xì)胞焦亡也會成為解釋中醫(yī)藥作用機(jī)制的有力證據(jù)。