芍藥苷對動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈斑塊、血脂及DNA甲基化的影響

【摘要】目的：探討芍藥苷對動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型主動(dòng)脈斑塊、血脂、血清甲基化及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平的影響。方法：30 只 8 周齡雄性 ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)9周后，隨機(jī)分為模型組、立普妥組（陽性對照組）和芍藥苷組。繼續(xù)喂養(yǎng)并藥物干預(yù)9周后，分別檢測三組小鼠血脂、血清 DNA 甲基化水平及 DNMT1水平;行HE染色，采用 IPP 圖像分析軟件測量小鼠主動(dòng)脈斑塊面積。結(jié)果：芍藥苷可減小動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈斑塊性對面積，降低血清TG、LDL-C水平，并降低血清DNA甲基化及DNMTI水平。結(jié)論：芍藥苷可通過降低血脂、血清甲基化及DNMT1 水平從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】芍藥苷;動(dòng)脈粥樣硬化;血脂;甲基化;DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號(hào)：R285.5

前言

心血管疾病是引起人類死亡的首要原因;據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國因病死亡人數(shù)中約2/5死于心血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化是包括冠狀動(dòng)脈粥樣性心臟病在內(nèi)的諸多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，因此有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化是預(yù)防及治療心血管疾病的基礎(chǔ)。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生過程中，脂代謝紊亂發(fā)揮著重要的作用;而DNA甲基化與脂代謝紊亂具有密切關(guān)系。芍藥苷是中藥赤芍的主要苷類化合物之一;研究表明，芍藥苷具有顯著的抗氧化能力及降脂和抑制主動(dòng)脈斑塊形成的作用。本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE -/- 小鼠為觀察對象，探討芍藥苷對動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的主動(dòng)脈斑塊、血脂及DNA甲基化的影響。

1.材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼料

30只6-8周齡ApoE-/-小鼠（雄性，品系C57BL/6J），體重約18-20g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。高脂飼料：21%脂肪（wt/wt）、0.15%膽固醇（wt/wt），購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0012。

1.2 藥物

芍藥苷購自澤朗醫(yī)藥公司生產(chǎn)（批號(hào)：20140315）;阿托伐他汀鈣（商品名立普妥）購自輝瑞制藥有限公司（批號(hào)：H20051408）。

1.3 分組及模型的制備

所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室，正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3日后，ApoE-/-小鼠更換為高脂飼料，自由采食攝水。9周后，隨機(jī)分為模型組、立普妥組，芍藥苷組（n=10）。據(jù)成人臨床推薦日用量，按體重系數(shù)比折算小鼠給藥量：立普妥3mg/kg ，芍藥苷0.12g/kg（折算系數(shù)為9.01，公式：成人日用量/60kg×9.01=小鼠日用量/kg）。藥物溶解于蒸餾水中，每日灌胃給藥1次，模型組給予等量蒸餾水灌胃，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)9周。

1.4 血脂的檢測

嚴(yán)格按照試劑盒說明書，檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.5 血清DNA甲基化及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平的檢測

嚴(yán)格按照試劑盒說明書，采用 ELISA 法檢測DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）水平。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測血清 DNA 甲基化水平。

1.6 主動(dòng)脈斑塊面積的測定

無菌條件下取各組小鼠心臟，經(jīng)脫水、包埋、切片，按照Suzuki等建立的方法，取小鼠主動(dòng)脈瓣起始橫斷面，每隔100μm取4張切片，切片厚5μm。行HE 染色，后使用IPP軟件測量各只小鼠斑塊面積，后計(jì)算斑塊占占管腔百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示。使用GraphPad Prism6.01軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，p﹤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的建立及芍藥苷對主動(dòng)脈斑塊的影響

藥物干預(yù)9周后，模型組小鼠主動(dòng)脈根部可見明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，伴大量膽固醇結(jié)晶伴泡沫細(xì)胞聚集（圖1A）。立普妥組（圖1B）及芍藥苷組（圖1C）斑塊相對面積較模型組顯著減小，立普妥組斑塊相對面積較芍藥苷組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 芍藥苷對動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血脂的影響

藥物干預(yù)9周后，與模型組相比，立普妥及芍藥苷可顯著降低血清TG與LDL-C水平;但立普妥降低甘油三酯水平較芍藥苷更為顯著;芍藥苷可顯著升高血清HDL-C水平。（表2）

2.3 芍藥苷降低動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT1水平

藥物干預(yù) 9周后，立普妥組及芍藥苷組小鼠血清DNA甲基化水平較模型組明顯降低;立普妥組與芍藥苷組之間無明顯差異。立普妥組與芍藥苷組小鼠血清DNMT水平較模型組亦明顯降低（P<0.01），兩組間無明顯差異。（表3）

3.討論

芍藥苷為常用傳統(tǒng)中藥芍藥的主要有效成分，是一種單萜類糖苷化合物，具有廣泛的藥理作用。研究表明，芍藥苷具有抗氧化，抗炎，抗凝、抗高血糖、降血脂及抗動(dòng)脈硬化等多種生物學(xué)效應(yīng)，且毒副作用較小。動(dòng)脈粥樣硬化是以脂代謝紊亂為主要病因的一類病理性血管疾病;自1999年以來，動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是一種慢性炎癥病變，而脂代謝紊亂則被認(rèn)為是血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生關(guān)鍵因素，在As過程中發(fā)揮著重要作用。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要方式，在維持生物體多種正常功能及疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究證實(shí)，在脂代謝紊亂過程中與脂代謝密切相關(guān)的多種基因存在著DNA甲基化現(xiàn)象。另外，DNA 甲基化可通過調(diào)控與AS有關(guān)的炎癥免疫細(xì)胞和炎癥因子來影響 AS 的發(fā)生與發(fā)展?；蚪M甲基化水平與冠心病及冠心病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。

本研究以高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備動(dòng)脈粥樣硬化模型，經(jīng)藥物干預(yù)治療后檢測其血脂、主動(dòng)脈斑塊相對面積及血清DNA甲基化及DNMT1水平以探討芍藥苷對動(dòng)脈粥樣硬化的作用。結(jié)果可見：芍藥苷可有效降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清TG及LDL-C水平，并可增加HDL-C水平，此種作用可能是芍藥苷發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的基礎(chǔ)。而芍藥苷降低基因組DNA甲基化水平及DNMT1水平可能是其發(fā)揮降低血脂的途徑之一;但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Eastwood JA， Doering LV， Dracup K， et al. Health-related quality of life： The impact of diagnostic angiograph[J]. Heart Lung， 2011， 40（2）： 147-155

[2] 陳偉偉， 高潤霖， 劉力生， 等. 中國心血管病報(bào)告2014概要[J]. 中國循環(huán)雜志， 2015， 30（07）： 617- 622.

[3]康群甫，周明學(xué)，孫麗，賈麗超，劉衛(wèi)紅.動(dòng)脈粥樣硬化脂代謝紊亂與DNA甲基化的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（23）：4586-4589.

[4]吳東方，靳善睿，劉娟，吳建華，肖艷紅，胡桑，喻紅.芍藥苷抗ApoE基因缺失小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用的初步研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（05）：385-388.

[5]許文平，王艷艷，孟笑瑋，王怡.芍藥苷對ApoE～（-/-）小鼠血脂及主動(dòng)脈斑塊的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（04）：210-212.

[6] Zhou MX， Xu H， Pan L， et al. Rosiglitazone promotes atherosclerotic plaque stability in fat-fed ApoE-knockout mice[J]. European Journal of Pharmacology， 2008， 590（1-3）： 297-302.

[7] Suzuki H， Kurihara Y， Takeya M， et al. A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection[J]. Nature， 1997， 386（6622）： 292-296.

[8] Zhang LL， Wei W， Wang NP， Wang QT， Chen JY， Chen Y， et al. Paeoniflorin suppresses inflammatory mediator production and regulates G protein-coupled signaling in fibroblast-like synoviocytes of collagen induced arthritic rats. Inflamm Res 2008;57：388–95.

[9]Hsu FL， Lai CW， Cheng JT. Antihyperglycemic effects of paeoniflorin and 8-debenzoylpaeoniflorin， glucosides from the root of Paeonia lactiflora. Planta Med 1997;63：323–5.

[10] Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease[J]. N Engl J Med. 1999. 340（2）： 115-126.

[11] 田海濤，曹芳英，朱智明等.心血管疾病不容忽視的問題：血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2013，2（3）：173-177.

[12] 楊海燕，王萍.溫膽湯對脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)基因Adiponectin 和 LDLR 甲基化的影響[J].江西中醫(yī)藥，2014，（11）：23-25.

[13]Revankar C M，Cimino D F，Sklar L A，et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling[J]. Science，2005，307（5715）：1625-1630.

[14]Yu J，Qiu Y，Yang J，et al.DNMT1-PPARγ pathway in macrophages regulates chronic inflammation and atherosclerosis development in mice[J].Sci Rep，2016，（17）：30053.