有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂肥胖大鼠心肌自由基代謝及胸主動(dòng)脈血管eNOS mRNA表達(dá)水平的影響

程愛佳 李光華 韓梅

摘?要：目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食肥胖大鼠胸主動(dòng)脈血管eNOS?mRNA表達(dá)水平及自由基代謝作用。方法：根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)不同將SD大鼠隨機(jī)分為3組（n=10），正常飲食組（CN）、高脂蛋白組（HD）、高脂蛋白復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)組（HE），HE大鼠每天游泳1次，90min/次，每周運(yùn)動(dòng)5天，持續(xù)8周。取心肌及胸主動(dòng)脈。檢測SD大鼠體重，LEES指數(shù)，心肌中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），胸主動(dòng)脈血管eNOS?mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果：與正常飲食組相比，高脂蛋白組心肌中的MDA含量升高，SOD含量降低（P<0.01）。與高脂蛋白組相比，高脂蛋白復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)組心肌MDA含量降低，SOD含量增加（P<0.01）。正常飲食組eNOS?mRNA基因表達(dá)水平顯著高于高脂蛋白組（P<0.05），高脂蛋白復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)組eNOS?mRNA基因表達(dá)水平高于高脂飲食組（P<0.05）。結(jié)論：有氧運(yùn)動(dòng)可改善胸主動(dòng)脈eNOS?mRNA表達(dá)水平，其機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化酶活力、減少自由基產(chǎn)生有關(guān)。

關(guān)鍵詞：有氧運(yùn)動(dòng);高脂;eNOS?mRNA;自由基

隨著社會(huì)的發(fā)展，肥胖已經(jīng)成為當(dāng)代社會(huì)的一個(gè)重要問題[1]。大量流行病學(xué)研究表明，肥胖與高血壓、冠心病、高脂血癥、糖尿病及某些腫瘤疾病發(fā)生有關(guān)[2]。肥胖是指一定水平上的脂肪層過厚與顯著超重，是因?yàn)闄C(jī)體攝入的熱量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于消耗的熱量，從而導(dǎo)致體內(nèi)的脂肪組織不能被消耗、利用，積存過多致使體重不斷增長，機(jī)體因此發(fā)生一系列生理與病理改變。肥胖對(duì)心血管影響研究的很多，而運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖心血管影響研究得較少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究適量運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂蛋白飲食所致的肥胖大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮性一氧化氮合酶（eNOS）基因表達(dá)水平與氧化代謝反應(yīng)的影響，以探討通過有氧游泳運(yùn)動(dòng)改善肥胖患者心血管功能狀態(tài)的可能性及其機(jī)理。

一、主要材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。雄性SD大鼠（寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）30只，體質(zhì)量180g左右，隨機(jī)分為3組，正常飲食組（CN）、高脂蛋白組（HD）、高脂蛋白復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)組（HE），每組10只，溫度環(huán)境為24°C，分籠飼養(yǎng)，高脂蛋白飲食8周，篩選出運(yùn)動(dòng)能力相近的大鼠。

（2）試劑與藥品。MDA（malondialdehyde，丙二醛）測定試劑盒、SOD（super?oxide?dismutase，超氧化物歧化酶）等，CHOL（總膽固醇）、TG（三酰甘油）、HDL（高密度脂蛋白）、LDL（低密度脂蛋白）全自動(dòng)生化分析儀，核糖核酸（RNA）提取液及反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

（二）肥胖大鼠模型制備

1.肥胖大鼠飼料營養(yǎng)成分

CN組：按每200g含38g蛋白質(zhì)、8g脂肪、132g糖、8g礦物質(zhì)、9g纖維素、酒石酸氫膽堿0.3g、1.9維生素，普通飼料均為顆粒狀。高脂蛋白飲食組，按高脂蛋白飲食飼料喂養(yǎng)，高脂飲食成分包括：巧克力、甜餅干、牛奶和花生，比率為2∶2∶2∶6;蛋白質(zhì)為40%、脂肪為40%、糖為38%、纖維素為8%。正常標(biāo)準(zhǔn)飲食的熱量為5.2kcal/g。高脂蛋白飲食熱量為6.1kcal/g（相當(dāng)于脂肪熱量的45%），

2.大鼠游泳運(yùn)動(dòng)模型

CN與HD兩組大鼠常溫環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，正?；顒?dòng)不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（游泳）。高脂蛋白飲食復(fù)合有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行有氧游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。游泳塑料大桶直徑為62cm的，水深度約為65cm，水溫度約為32±1℃。HE組大鼠在前3天分別游泳時(shí)間逐漸遞增，分別每天為30、60和90min，然后適應(yīng)性游泳1周后，開始正式游泳訓(xùn)練，連續(xù)8周，每天游泳時(shí)間固定為90min。期間，游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練每周5天，周三與周天休息。

（三）血清處理方法

樣品制備等大鼠8周游泳有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，禁食24小時(shí)即可，采用20%烏拉坦（0.5mL·kg1體重）通過大鼠腹腔麻醉，注射針頭刺入心臟內(nèi)直接采全血5ml，高速離心30min，吸取上部血清，置于-80℃低溫冰箱保存、待測。心臟組織有眼科剪迅速剪取小片心臟組織，然后用0.85%的生理鹽水沖洗，然后用濾紙吸干。按重量（W（g））：體積（V（ml））=1∶9生理鹽水制成濃度為10%組織勻漿液。根據(jù)試劑盒要求處理、離心后，抽取上清液，放-80℃冰箱保存、待用。

（四）基因指標(biāo)檢測

大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮性一氧化氮合酶（eNOS）mRNA基因表達(dá)水平的測定。

1.引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)National?Center?for?Biotechnology?Information（NCBI）上大鼠eNOS的mRNA數(shù)據(jù)與信息，作者提出要求，由北京生物工程有限公司設(shè)計(jì)引物并合成，并按要求分離與提取總RNA：參照AXYGEN?RNA?提取試劑盒步驟說明，提取大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)標(biāo)本中總RNA。

2.核糖核酸（RNA）反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增

總量為40ul的反應(yīng)體系，約16μl提取的總RNA，2μl隨機(jī)六聚體引物，1μlOligo（dT）18?Primer，1μl無酶水，30～40pmol基因特異性引物，4μl5XReaction?Buffer，4μl10mMdNTP?MIX，2μlRiboLockTM?RNA酶抑制劑，2μlRevertAidTMMMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在37℃反轉(zhuǎn)錄60min后，90℃變性5min，室溫環(huán)境下高速離心5s后獲得RT產(chǎn)物（cDNA），然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。