代謝工程改造谷氨酸棒桿菌合成四氫嘧啶

潘嵐君，姜 灝，趙桂紅，賈 黎，肖詩韻，付馨蕊，李燕軍*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

四氫嘧啶（ectoine）是一種環(huán)狀氨基酸衍生物，作為一種滲透壓補償性溶質(zhì)，最早在光合細菌極端外硫紅螺菌（Ectothiorhodospira halochloris）中被發(fā)現(xiàn)[1]。四氫嘧啶受到環(huán)境脅迫條件（如高滲、干旱和極端溫度）的影響，并廣泛存在于嗜鹽細菌、嗜鹽古菌、真菌及鹽藻等細胞中[2-3]。由于其具有極強的大分子、細胞和組織保護能力，四氫嘧啶被認為具有很高的商業(yè)價值[4-5]。目前主要應(yīng)用于護膚[6]和治療疾病方面[7-8]（如阿爾茨海默癥）。此外，四氫嘧啶還作為相容性物質(zhì)可用于加強酶和核酸等生物大分子的穩(wěn)定性，從而提高生物過程加工的效率[9-10]。

四氫嘧啶中含有一個手性碳原子，通過化學(xué)法合成困難且復(fù)雜，目前主要通過微生物發(fā)酵法合成。四氫嘧啶經(jīng)典的商業(yè)化生產(chǎn)方法是利用嗜鹽細菌——伸長鹽單胞菌（Halomonas elongata）進行[11]，該方法優(yōu)點在于細胞可以反復(fù)利用，但操作復(fù)雜，成本較高。多年來，研究者們嘗試在常用的工業(yè)微生物中構(gòu)建四氫嘧啶合成途徑。BESTVATER T等[12]在大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中表達海生嗜鹽球菌（Marinococcus halophilus）的操縱子ectABC，實現(xiàn)了0.4 mmol/g細胞干質(zhì)量四氫嘧啶積累，由于使用了操縱子自身的啟動子元件，仍然需要高鹽的誘導(dǎo)條件；NING Y K等[13]利用pTrc99a質(zhì)粒在大腸桿菌中表達伸長鹽單胞菌（H.elongate）的操縱子ectABC，同時引入谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）解除反饋抑制的天冬氨酸激酶（lysC編碼）強化天冬氨酸-β-半醛的供應(yīng)，敲除高絲氨酸脫氫酶（thrA編碼）減弱代謝支路，失活乙醛酸循環(huán)的阻遏蛋白IclR，最終菌株在不需要高鹽的條件下積累25.1 g/L四氫嘧啶。

谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）是革蘭氏陽性安全菌株，在氨基酸發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用了幾十年，尤其是利用谷氨酸棒桿菌年產(chǎn)百萬噸級的谷氨酸和賴氨酸。由于四氫嘧啶和賴氨酸共用前體物為天冬氨酸-β-半醛，因此改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶可能具有較大的潛力。BECKER J等[14]在賴氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌LYS-1的基礎(chǔ)上表達伸長鹽單胞菌（H.elongate）的操縱子ectABCD，四氫嘧啶積累量可達4.5g/L。PéREZ-GARCíA F等[15]以賴氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌DM1729為出發(fā)菌，通過pVWEx1質(zhì)粒表達來源于需鹽色鹽桿菌（Chromohalobacter salexigens）的操縱子ectABC，同時敲除全局調(diào)控基因sugR和乳酸脫氫酶基因ldhA，最終菌株產(chǎn)生22 g/L四氫嘧啶，但是操縱子ectABC的表達需要異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）的誘導(dǎo)。

本研究以野生型谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）ATCC 13032為研究對象，以賴氨酸積累量為評價指標，通過代謝工程手段強化天冬氨酸-β-半醛的供應(yīng)；然后敲除賴氨酸輸出蛋白基因lysE，組成型表達不同來源的四氫嘧啶操縱子ectABC，促進天冬氨酸-β-半醛流向四氫嘧啶的合成。本研究將為開發(fā)常規(guī)工業(yè)微生物生產(chǎn)四氫嘧啶、替代現(xiàn)行的嗜鹽菌復(fù)雜工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶XbaI、KpnI、HindIII、BamHI，PrimerSTAR HS 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：大連TaKaRa公司；DNA Marker：北京博邁德科技發(fā)展有限公司；2×TaqMaster Mix、ClonExpressTMII（重組酶）：諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA直接回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒：美國Omega Bio-TeK公司；硫酸卡那霉素、硫酸鏈霉素、氯霉素：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

腦心浸液液體培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）：腦心浸液肉湯37.5 g/L，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

腦心浸液固體培養(yǎng)基：在BHI液體培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉。根據(jù)實驗需要添加抗生素，其中大腸桿菌硫酸卡那霉素工作質(zhì)量濃度為50 μg/mL，氯霉素工作質(zhì)量濃度為30 μg/mL；谷氨酸棒桿菌硫酸卡那霉素工作質(zhì)量濃度為10 μg/mL，氯霉素工作質(zhì)量濃度為12 μg/mL，鏈霉素工作質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，維生素B1（vitamin B1，VB1）0.5 mg/L，VH 0.1 mg/L，酵母粉5 g/L，玉米漿30 mL/L（400 g/L，121 ℃、20 min單獨滅菌），豆粕水解液15 mL/L，pH 7.0～7.2。115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，（NH4）2SO48 g/L，KH2PO41.6 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VB10.5 mg/L，VH 80 μg/L，蛋氨酸0.5 g/L，谷氨酸1 g/L，玉米漿35 mL/L（400 g/L，121 ℃、20 min單獨滅菌），豆粕水解液20 mL/L，pH 7.0～7.2。115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GL20A高速冷凍離心機：日本日立公司；ZWYR-D2403搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；PTC-1148聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、ScanDrop 100核酸定量分析儀：美國BIO-RAD公司；DYYIII2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠；Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；Eporator電擊轉(zhuǎn)化儀：德國Eppendorf公司；752分光光度計：上海分析儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市科學(xué)儀器廠；SS-325全自動滅菌鍋：日本TOMY儀器有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：廣東醫(yī)療器械廠；Agilent 1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究所用的引物見表2。質(zhì)粒構(gòu)建以E.coliDH5α為克隆宿主。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表

過表達質(zhì)粒pXtuf-ectABC的構(gòu)建：分別以施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）ATCC 17588的基因組和pTrcECT質(zhì)粒[13]為模板，擴增目的片段PSectABC和HEectABC。同時委托金唯智公司根據(jù)谷氨酸棒桿菌偏好性進行密碼子優(yōu)化和基因合成，獲得PSectABCopt和HEectABCopt基因片段。擴增目的基因時在引物上添加與載體線性化后兩側(cè)同源的序列。用限制性核酸內(nèi)切酶Hind III和BamH I酶切pXtuf質(zhì)粒，得到線性化載體。利用同源重組的方法將目的基因和線性載體連接，獲得ectABC操縱子過表達質(zhì)粒pXtuf-PSectABC、pXtuf-PSectABCopt、pXtuf-HEectABC和pXtuf-HEectABCopt。菌落PCR用pXtuf質(zhì)粒上Ptuf-ident引物和相應(yīng)目的片段的下游引物鑒定，并送至金唯智公司進行測序驗證。

基因組編輯pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒的構(gòu)建：分別擴增基因組編輯位點的上下游同源臂、啟動子片段和目的基因片段，各片段通過引物設(shè)計包含依次同源的序列，借助重疊PCR方法將各片段連接起來。同時用XbaI和KpnI雙酶切pK18mobrpsL進行載體線性化。利用同源重組的方法將重疊片段和線性載體連接，獲得pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒。菌落PCR鑒定采用通用引物M13-47和RV-M進行。

基因擴增PCR體系：5×Buffer 20 μL；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol）8 μL；引物1和引物2各4 μL；模板DNA（200～500 ng/μL）1 μL；Primer STAR HS DNA聚合酶1 μL；用雙蒸水補至100 μL。

基因擴增PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火（復(fù)性）30 s；72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

菌落PCR體系：雙蒸水6.5 μL；引物1和引物2各0.5 μL；2×TaqMaster Mix 7.5 μL。

菌落PCR程序：95 ℃預(yù)變性8 min；98 ℃變性30 s；55 ℃退火（復(fù)性）30 s；72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

1.3.2 菌株構(gòu)建

谷氨酸棒桿菌基因組編輯采用作者團隊開發(fā)的基于卡那霉素和鏈霉素篩選的兩次同源交換技術(shù)[16]。菌株構(gòu)建方法如下：將pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細胞中，涂布在含有10 μg/mL卡那霉素的BHI固體平板上，32 ℃培養(yǎng)，待長出菌落后用相應(yīng)的鑒定引物ident-F和RV-M（或M13-47和ident-R）鑒定，若有大小符合預(yù)期的條帶則表示發(fā)生了一輪交換；隨后將鑒定正確的單交換菌落接入含有卡那霉素的BHI搖管中，于32 ℃培養(yǎng)12 h后稀釋涂布到含有50 μg/mL鏈霉素的平板上，待長出菌落后用相應(yīng)的引物對ident-F和ident-R進行菌落PCR驗證，若條帶大小符合預(yù)期則表示第二輪交換成功。提取基因組、擴增相應(yīng)片段并進行測序，最終確定獲得正確的基因組編輯菌株。

過表達菌株的獲得為將相應(yīng)的pXtuf-ectABC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中，涂布在含12 μg/mL氯霉素的BHI平板上，用構(gòu)建質(zhì)粒時使用的引物進行菌落PCR鑒定。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

菌種活化：用接種環(huán)從保菌管中取一環(huán)劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基，32 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)20～24 h，即得到一代活化菌種。然后用接種環(huán)取一環(huán)菌體接種于另一支試管斜面，32 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)12 h，得到二代活化菌種。

種子搖瓶培養(yǎng)：取活化好的二代試管斜面，用接種環(huán)刮取表層菌體，接種到裝液量為30 mL/500 mL種子培養(yǎng)基中，置于往復(fù)旋轉(zhuǎn)式搖床上，200 r/min、32 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12～14 h，測定OD600nm值。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：按10%（V/V）的接種量將種子液接入裝液量為30 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于往復(fù)旋轉(zhuǎn)式搖床上，200 r/min、32 ℃條件下培養(yǎng)，定期測定OD600nm值，發(fā)酵48 h結(jié)束，取樣測定賴氨酸或四氫嘧啶的質(zhì)量濃度。

1.3.4 測定方法

賴氨酸質(zhì)量濃度測定：取適量發(fā)酵液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min 離心2 min后取上清，用去離子水稀釋適當倍數(shù)備用，經(jīng)2,4-二硝基氟苯衍生后過濾0.2 μm濾膜，進樣HPLC檢測，其色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA氨基酸分析柱（150 mm×4.6 mm）；流動相A：50%（V/V）的乙腈溶液，流動相B：50 mmol/L乙酸鈉溶液，流動相A和B的比例為1∶1（V/V），流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測波長360 nm；采用自動進樣器進樣，進樣體積設(shè)置為10 μL。

四氫嘧啶質(zhì)量濃度測定：采用Agilent 1100高效液相色譜儀進行檢測，其色譜條件：色譜柱為Phenomenex Gemini 5u C18（250 mm×4.6 mm）；流動相為2%乙腈，單泵模式，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測波長210 nm；采用自動進樣器進樣，進樣體積設(shè)置為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 以賴氨酸積累量為評價指標強化天冬氨酸-β-半醛的合成途徑

以鏈霉素抗性谷氨酸棒桿菌野生菌株出發(fā)構(gòu)建四氫嘧啶生產(chǎn)菌，為了增強前體物天冬氨酸-β-半醛的代謝流，以賴氨酸積累量為評價指標進行測試。谷氨酸棒桿菌的賴氨酸代謝工程改造策略相對已經(jīng)成熟[17]，其中丙酮酸羧化酶（pyc編碼）、天冬氨酸激酶（lysC編碼）和高絲氨酸脫氫酶（hom編碼）催化的途徑為關(guān)鍵步驟[18]。為了解除草酰乙酸和天冬氨酸對丙酮酸羧化酶的反饋抑制，首先點突變pyc基因[17]，引入丙酮酸羧化酶P458S突變體，然后將pyc啟動子替換為強啟動子Psod，獲得菌株LYS-1。天冬氨酸激酶催化的反應(yīng)是天冬氨酸組氨基酸合成的關(guān)鍵位點，受到賴氨酸、蘇氨酸等產(chǎn)物的反饋抑制[19]。通過突變lysC基因引入C932T突變體，然后將基因lysC啟動子替換為Psod啟動子，同時將起始密碼子GTG改為ATG，在解除天冬氨酸激酶反饋抑制的同時強化其表達，獲得菌株LYS-2。高絲氨酸脫氫酶催化天冬氨酸-β-半醛生成高絲氨酸，進入蘇氨酸和異亮氨酸的合成。作為競爭天冬氨酸-β-半醛的重要代謝支路，高絲氨酸脫氫酶的弱化表達非常關(guān)鍵。與直接失活該酶構(gòu)件營養(yǎng)缺陷型菌株相比，引入滲漏型表達突變體為更好的策略，因為其在極大上程度控制代謝支流的同時，避免在培養(yǎng)基中添加蘇氨酸等物質(zhì)（增加生產(chǎn)成本和使工藝復(fù)雜化）。引入高絲氨酸脫氫酶滲漏型突變體[18]，獲得菌株LYS-3。

對這3株菌進行了搖瓶培養(yǎng)，48 h時取樣測定，3株谷氨酸棒桿菌強化天冬氨酸-β-半醛供應(yīng)的工程菌株的賴氨酸積累量見圖1。

圖1 3株谷氨酸棒桿菌強化天冬氨酸-β-半醛供應(yīng)的工程菌株的L-賴氨酸積累量Fig.1 L-lysine accumulation of 3 Corynebacterium glutamicum engineering strains fortified with aspartic acid-βsemialdehyde supply

由圖1可知，菌株LYS-1積累了3.02 g/L賴氨酸，出發(fā)菌株C.glutamicumstrpR的培養(yǎng)液中檢測不到賴氨酸的分泌，說明強化丙酮酸羧化酶的表達，確實有助于賴氨酸的合成。與之相比，天冬氨酸激酶的改造菌株LYS-2的賴氨酸積累量大幅度提高，達到了25.05 g/L，可見突變天冬氨酸激酶發(fā)揮著重要的作用。在此基礎(chǔ)上，弱化高絲氨酸脫氫酶的表達進一步促進了賴氨酸的生成量。由此可見，經(jīng)過對野生菌株3個位點的理性改造，成功構(gòu)建了一株高產(chǎn)賴氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株LYS-3，賴氨酸積累量為28.48 g/L，其流經(jīng)天冬氨酸-β-半醛的代謝流較為通暢，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

2.2 引入異源基因構(gòu)建四氫嘧啶合成途徑

敲除菌株LYS-3的賴氨酸輸出蛋白基因lysE，獲得菌株LYS-4，作為表達異源四氫嘧啶合成的出發(fā)菌株。阻斷賴氨酸輸出通道后，賴氨酸無法排出細胞，胞內(nèi)積累賴氨酸也會反饋抑制賴氨酸合成的關(guān)鍵酶，使得天冬氨酸-β-半醛不會過量流向賴氨酸合成方向。從天冬氨酸-β-半醛合成賴氨酸的第一個酶（二氫吡啶二羧酸合酶）為關(guān)鍵酶，其受到賴氨酸的強烈反饋抑制作用[19]。為了對比施氏假單胞菌（P.stutzeri）和伸長鹽單胞菌（H.elongate）四氫嘧啶合成操縱子的作用效果，分別從施氏假單胞菌（P.stutzeri）基因組上擴增操縱子PSectABC，從pTrcECT質(zhì)粒[13]擴增HEectABC，同時根據(jù)谷氨酸棒桿菌進行密碼子優(yōu)化和基因合成，獲得PSectABCopt和HEectABCopt。以含有Ptuf啟動子的pXMJ19衍生質(zhì)粒pXtuf為框架，在谷氨酸棒桿菌LYS-4中分別表達這4個操縱子（PSectABC、PSectABCopt、HEectABC、HEectABCopt），得到菌株ECT-1、ECT-2、ECT-3、ECT-4。以攜帶空質(zhì)粒的菌株（菌株ECT-0）為對照，進行搖瓶發(fā)酵。

菌株ECT-0、ECT-1、ECT-2、ECT-3、ECT-4的生物量積累及四氫嘧啶產(chǎn)量分別見圖2和圖3。

圖2 表達不同ectABC谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的生物量積累Fig.2 Biomass accumulation of Corynebacterium glutamicum strains expressing different ectABC in shake flask culture

圖3 表達不同ectABC谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的四氫嘧啶產(chǎn)量Fig.3 Ectoine production of Corynebacterium glutamicum strains expressing different ectABC in shake flask culture

由圖2可知，與對照相比，表達PS來源操縱子的菌株ECT-1和ECT-2在24 h前生長變慢，但是24 h以后，菌株ECT-2的生物量呈現(xiàn)線性增長的趨勢。表達HE來源基因的菌株ECT-3和ECT-4前期生長與對照菌株相當，后期生物量高于對照。

由圖3可知，操縱子ectABC來源相同的菌株，四氫嘧啶產(chǎn)量越低菌株生長越好，可能由于基因表達效率存在差異，導(dǎo)致質(zhì)粒的負荷不同。另外，四氫嘧啶為相容性物質(zhì)，對細胞具有一定的保護性，也可能是影響菌株生長性能的一個原因。表達異源四氫嘧啶操縱子的谷氨酸棒桿菌均積累了一定濃度的四氫嘧啶。然而，密碼子優(yōu)化大幅降低了其產(chǎn)量。未進行密碼子優(yōu)化的菌株ECT-1和ECT-3均產(chǎn)生了高質(zhì)量濃度的四氫嘧啶，其中菌株ECT-3（表達HEectABC）的四氫嘧啶產(chǎn)量最高，達到17.21 g/L。由于ectABC為操縱子結(jié)構(gòu)，進行PSectABC密碼子優(yōu)化時并未改變后兩個基因的RBS區(qū)。對于HEectABC，后兩個基因區(qū)也可能各自帶有啟動子區(qū)（類似于海生嗜鹽球菌的情況[12]），對基因間隔序列也無優(yōu)化。盡管如此，兩組密碼子均導(dǎo)致四氫嘧啶產(chǎn)量大幅降低，優(yōu)化后基因可能導(dǎo)致操縱子基因或轉(zhuǎn)錄的mRNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響基因表達。

2.3 強化天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NADPH再生途徑

3株過表達基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的四氫嘧啶產(chǎn)量比較結(jié)果見圖4。

圖4 過表達基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的四氫嘧啶產(chǎn)量Fig.4 Ectoine production of Corynebacterium glutamicum overexpressing gene aspC and ECpntAB in shake flask

由圖4可知，將天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因aspC的啟動子替換為Psod，菌株ECT-5四氫嘧啶的產(chǎn)量提高了19.7%。由于生產(chǎn)1分子四氫嘧啶需要消耗3分子還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），因此，在基因組整合表達了來自大腸桿菌的轉(zhuǎn)氫酶（pntAB編碼），結(jié)果表明四氫嘧啶產(chǎn)量進一步提高6.1%，達到21.85 g/L。表達大腸桿菌pntAB增強NADPH供應(yīng)為代謝工程改造的有效策略[20-21]，本研究中也促進了合成過程高需求NADPH的四氫嘧啶的生產(chǎn)。

天冬氨酸-β-半醛為天冬氨酸族產(chǎn)物合成的關(guān)鍵中間代謝物，強化其合成代謝流是保證四氫嘧啶高產(chǎn)的重要因素。從天冬氨酸-β-半醛出發(fā)，過表達2,4-二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（ectB編碼）也可以合成重要化合物2,4-二氨基丁酸，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物材料方面具有重要的應(yīng)用價值[22]。引入DABA脫羧酶可以進一步延伸至產(chǎn)品1,3-丙二胺[23]，二胺是合成聚氨酯、尼龍的單體物質(zhì)，還包括腐胺（1,4-丁二胺）[24]和尸胺（1,5-戊二胺）[25]等。

3 結(jié)論

本研究以谷氨酸棒桿菌野生菌株ATCC 13032為出發(fā)菌株，通過理性代謝工程策略構(gòu)建了四氫嘧啶高效生產(chǎn)菌株，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量可達21.85 g/L，接近目前報道的最高水平。結(jié)果表明，以賴氨酸積累量為評價指標，可以有效將細胞代謝流導(dǎo)向天冬氨酸-β-半醛，為其衍生物合成奠定基礎(chǔ)。表達異源操縱子基因時，密碼子優(yōu)化可能會帶來不利影響。研究結(jié)果為四氫嘧啶等天冬氨酸-β-半醛衍生物的合成提供參考。后續(xù)將進行系統(tǒng)代謝工程改造，提升菌株四氫嘧啶生產(chǎn)性能，并進行實驗室水平發(fā)酵罐發(fā)酵過程優(yōu)化研究。