齊整小核菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基優(yōu)化研究

張 麗，柳昊睿，趙馨儀，翟 麗，黃福山，黃正梅，王 敏*

（1.德州昂立達(dá)生物技術(shù)有限公司，山東 德州 253000；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個(gè)單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)、食品科學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域中的熱點(diǎn)研究內(nèi)容之一[1-3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐級(jí)認(rèn)識(shí)到糖及其復(fù)合分子具有極其重要的生物學(xué)功能，多糖具有抗凝血、抗感染、降血糖和降血脂等作用。多糖還可以控制細(xì)胞分裂和老化，與細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等都有著密切的關(guān)系[4-8]。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，利用生物技術(shù)生產(chǎn)聚合物和生物分子得到了長足的發(fā)展。與傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)相比，生物技術(shù)具有化石資源消耗少、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)。一些微生物最近被用于經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)微生物多糖。硬葡聚糖是一種非離子型、水溶性多糖，是由絲狀真菌小核菌屬純培育發(fā)酵獲取，此中最典范的是齊整小核菌。小核菌多糖[9-11]擁有良好的水溶性、粘度、增稠性和穩(wěn)定性[12]。近幾年來，國內(nèi)外的研究者對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)多糖的優(yōu)化方面也做了大量研究，WANG L Y等[13]利用一株新菌株Kosakonia cowaniiLT-1進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的研究。通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，了解蔗糖對(duì)胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）生物合成的影響。向蓉等[14]通過探究龍眼多糖添加量、發(fā)酵時(shí)間、接種量和初始pH對(duì)丁酸梭菌活菌量的影響，使總多糖含量比發(fā)酵前提高了464.65 mg/mL。FENG J等[15]通過優(yōu)化發(fā)酵條件將靈芝的細(xì)胞內(nèi)多糖產(chǎn)量提高到1.98 g/L。

考慮不同培養(yǎng)條件對(duì)齊整小核菌發(fā)酵產(chǎn)多糖量[14]的影響，從氮源、碳源、無機(jī)鹽等多個(gè)因素進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化和設(shè)計(jì)。近年來，多糖被廣泛用于制藥、化工和保健品行業(yè)中，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，需求量不斷增加[17-18]。隨著我國人民生活水平逐步的提高，多糖產(chǎn)品在國內(nèi)市場的需求量也將逐漸增加。因此，對(duì)于怎樣提高多糖產(chǎn)量顯得尤為重要，首先利用Plackett-Burman法[19-20]可以快速有效的從許多因素中篩選出較為首要的幾個(gè)因素，其次利用最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基的配方[21-23]。本研究將對(duì)齊整小核菌發(fā)酵產(chǎn)多糖的培養(yǎng)基中的碳源、氮源以及無機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，提高其胞外多糖產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種

齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）ATCC 15205：保藏于天津科技大學(xué)微生物制藥研究室。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；七水硫酸鎂、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖（均為分析純）：天津市耀華化工廠；磷酸氫二鉀、氯化鈉、硝酸鈉、氯化鉀、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅、磷酸、乙醇（均為分析純）：天津化學(xué)試劑二廠。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：葡萄糖100.0 g/L，NaNO33.0 g/L，KH2PO41.3 g/L，檸檬酸0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，維生素B13.3 mg/L，ZnSO4·7H2O 3.3 mg/L，酵母提取物1.0 g/L。pH=4.5～4.7（磷酸調(diào)節(jié)）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，水1 000 mL，自然pH。

1.2 儀器與設(shè)備

LD5-10型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；EMS-4B磁力攪拌器：天津歐諾儀器儀表有限公司；Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)：美國安捷倫公司；HYG-II回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；DL102型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；754PC紫外-可見光分光光度計(jì)：上海菁花科技有限公司；FA2204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ZHJH-1112超凈臺(tái)：上海智誠分析儀器制造有限公司；SS-325型全自動(dòng)滅菌鍋：日本TOMY儀器有限公司；SAB-40E生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖工藝流程及操作要點(diǎn)

配制培養(yǎng)基并滅菌→接種→液體發(fā)酵→過濾→濃縮→除蛋白、色素等→醇沉→離心并干燥→粗多糖

操作要點(diǎn)：

（1）接種：按5%接種量向發(fā)酵液中接入種子液。

（2）發(fā)酵：發(fā)酵液酸度4.5%～5.5%，接種溫度28～30 ℃；發(fā)酵溫度27～29 ℃培養(yǎng)時(shí)間66～70 h。

（3）過濾、濃縮：選用壓濾形式過濾除去發(fā)酵菌絲體等，收集澄清發(fā)酵液；選用蒸發(fā)提取等形式濃縮發(fā)酵液，提高多糖濃度；

（4）除蛋白、色素等：選用Servage法去除蛋白質(zhì)；選用添加活性炭等形式去除色素等；

（5）醇沉：按照4倍體積添加無水乙醇，4 ℃靜置過夜。

（6）離心干燥：醇沉過夜后，5 000 r/min離心20 min，倒出有機(jī)溶劑收集沉淀部分冷凍干燥，得到粗多糖。

1.3.2 多糖含量測定方法

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，定容至100 mL容量瓶中，上下?lián)u晃使之完全溶解，配成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于試管中，加去離子水至1.0 mL，再分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后加入5 mL濃硫酸搖勻，此過程需在冰水浴中進(jìn)行。最后置于30℃水浴中反應(yīng)30min，于波長490 nm測吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）多糖的提取及含量測定

取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的齊整小核菌發(fā)酵液2 mL于離心管中，12 500 r/min離心5 min，取1 mL上清于EP管中，加4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，進(jìn)行醇沉，沉淀部分加10 mL水復(fù)溶，得到溶液①，取1 mL溶液①補(bǔ)水至10 mL得到溶液②。用Sevage法除蛋白，再用去離子水透析48 h，最后將多糖溶液在200～400 nm處進(jìn)行掃描，收集在波長260 nm和280 nm處無吸收峰和無蛋白的組分，并采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量[24-25]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）碳源篩選

以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別考察質(zhì)量濃度為100g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露醇6種碳源對(duì)發(fā)酵效果的影響。于100 mL/250 mL搖瓶中接種對(duì)數(shù)期齊整小核菌液5%，置于28 ℃培養(yǎng)箱中220 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，按苯酚硫酸法測定多糖含量，每種碳源做三組平行。

（2）氮源篩選

在碳源篩選的基礎(chǔ)上，分別采用胰蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨作為氮源，每種氮源含量設(shè)定為6 g/L，其余步驟與測定碳源相同，根據(jù)多糖產(chǎn)量，選擇合適的氮源種類。

1.3.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照1.3.3中對(duì)碳源和氮源種類的篩選結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論，分別以葡萄糖和胰蛋白胨為碳、氮源，結(jié)合影響齊整小核菌發(fā)酵狀態(tài)主要的無機(jī)鹽NaNO3、KCl和FeSO4，并進(jìn)一步結(jié)合培養(yǎng)基必需的MgSO4和K2HPO4等7個(gè)因素，采用PB試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基組分中對(duì)于齊整小核菌發(fā)酵所得期望值影響顯著的因素。以篩選培養(yǎng)基各成分中對(duì)多糖產(chǎn)量影響最為顯著的若干因子。

1.3.5 最陡爬坡試驗(yàn)與Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)，并進(jìn)一步進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，依據(jù)此方案進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析從而獲得最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用該軟件的數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型，并對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證，利用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選結(jié)果

在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和果糖作為碳源，把每種碳源含量設(shè)定為100 g/L。制備培養(yǎng)基，檢測每種碳源發(fā)酵條件下胞外多糖產(chǎn)量，培養(yǎng)基裝液量為100 mL/250 mL，再分別以5%的接種量接入種子液，200 r/min、28 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。每種碳源分別做3組平行試驗(yàn)，測定多糖產(chǎn)量，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，多糖產(chǎn)量最高，為（16.54±1.16）g/L。因此，最適碳源為葡萄糖。

圖1 不同碳源對(duì)齊整小核菌多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on polysaccharide yield of Sclerotium rolfsii

2.2 氮源篩選結(jié)果

在碳源篩選的基礎(chǔ)上考察氮源種類對(duì)齊整小核菌產(chǎn)胞外多糖的影響。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，在其他組分不變的情況下，分別采用6 g/L胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、大豆蛋白胨作為氮源，替換培養(yǎng)基中的氮源，再分別以5%的接種量接入種子液，200 r/min、28 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。每種氮源培養(yǎng)基平行3次試驗(yàn)，測定每種氮源培養(yǎng)基的多糖產(chǎn)量，以選擇適合的氮源種類，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)胰蛋白胨作為氮源時(shí)，多糖產(chǎn)量最高，為17.23 g/L。因此，最適氮源為胰蛋白胨。

圖2 不同氮源對(duì)齊整小核菌多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on polysaccharide yield of Sclerotium rolfsii

2.3 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.4的方法，采用Plackett-Burman試驗(yàn)，篩選培養(yǎng)基組分（葡萄糖、胰蛋白胨、NaNO3、KCl、K2HPO4、MgSO4和FeSO47個(gè)因素分別以X1～X7表示，以及X8～X11四個(gè)虛擬項(xiàng)）中對(duì)于齊整小核菌發(fā)酵所得胞外多糖期望值影響顯著的因素。其中各因素的水平設(shè)置及結(jié)果分析分別如表1、表2所示，對(duì)所有的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析得到的多元一次方程為：Y=15.40+2.92X1+0.069X2+2.51X3-0.23X4-0.35X5-2.04X6-0.69X7。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and level of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and results of Plackett-Burman experiments

續(xù)表

用常規(guī)的F檢驗(yàn)方法分析模型，齊整小核菌多糖產(chǎn)量影響因素的主效應(yīng)分析結(jié)果如表3所示。由表3可知，線性模型P=0.036 5整體達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明該模型顯著可靠，可以較好地描述試驗(yàn)影響因素與多糖產(chǎn)量之間的關(guān)系。發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)齊整小核菌多糖產(chǎn)量的影響效應(yīng)大小依次為：葡萄糖、NaNO3、MgSO4、FeSO4、K2HPO4、KCl、胰蛋白胨。其中葡萄糖、NaNO3和MgSO4均是顯著影響因子（P＜0.05）。因此，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果確定對(duì)葡萄糖、NaNO3和MgSO4進(jìn)行最陡爬坡路徑設(shè)計(jì)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)的回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of Plackett-Burman experiments

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

通過PB試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)顯著影響多糖產(chǎn)量的因素有葡萄糖、NaNO3和MgSO4。進(jìn)一步通過最陡爬坡路徑試驗(yàn)，優(yōu)化葡萄糖、NaNO3、MgSO4添加量的水平，獲得最佳培養(yǎng)基配方，其中試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表4 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest climbing path experiments

結(jié)果顯示，葡萄糖和NaNO3沿最速上升方向，MgSO4沿最速下降方向按照設(shè)計(jì)的濃度梯度變化。1～6組多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖含量為140 g/L、NaNO3含量為3.32 g/L和MgSO4含量為0.92 g/L時(shí)，對(duì)應(yīng)的多糖產(chǎn)量最多為22.57 g/L，為最大響應(yīng)值區(qū)域。

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3個(gè)重要因子的最適濃度范圍確定后，以葡萄糖（A）140 g/L、NaNO3（B）3.32 g/L、MgSO4（C）0.92 g/L為中心點(diǎn)，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，多糖產(chǎn)量（Y）的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)測定結(jié)果見表5。

表5 Blackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Blackett-Burman experiments

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到該模型的二次擬合回歸方程為：

Y=17.03+3.26A+2.58B-1.71C+1.17AB-0.81AC+0.28BC-1.28A2-0.49B2-0.44C2，其中Y為多糖產(chǎn)量的預(yù)測值，A、B、C分別是葡萄糖、NaNO3、MgSO4質(zhì)量濃度的編碼水平。AB、AC、BC分別是葡萄糖和NaNO3含量、葡萄糖和MgSO4、NaNO3和MgSO4對(duì)小核菌多糖產(chǎn)量交互影響的編碼水平，響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表6。

表6 Blackett-Burman試驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 6 Regression analysis results of Blackett-Burman experiments

如表6所示，該模型的一次項(xiàng)A、B和C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AB以及二次項(xiàng)A2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。此外葡萄糖和NaNO3含量的變化對(duì)小核菌多糖產(chǎn)生的交互作用影響較大。該模型選取95%的置信度，二次多項(xiàng)式方差分析結(jié)果表明，模型極顯著（P＜0.01），回歸結(jié)果比較理想，失擬項(xiàng)沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05），表明非試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果影響有限，所擬合的模型可靠性很高，該模型可以用于小核菌多糖培養(yǎng)基優(yōu)化的分析和理論預(yù)測。

除上述小核菌多糖產(chǎn)量預(yù)測值與真實(shí)值比對(duì)外，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件來繪制三維響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖，將該模型中單一變量之間相互作用對(duì)小核菌多糖產(chǎn)量進(jìn)行表征。不同影響因子之間交互作用的三維曲面圖與相應(yīng)的等高線圖見圖3。

圖3 各因素交互作用對(duì)多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on exopolysaccharide yield

2.6 最佳胞外多糖產(chǎn)量及模型驗(yàn)證

用Design-Expert 8.0.6.1軟件中Box-Behnken軟件對(duì)響應(yīng)面模型進(jìn)行典型性分析，求得的響應(yīng)值理論值為23.18 g/L。此時(shí)可得發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為葡萄糖135.96 g/L、NaNO33.80g/L、MgSO40.39g/L，胰蛋白胨6.96g/L、KCl0.5g/L、K2HPO41.34 g/L、MgSO40.39 g/L和FeSO40.017 g/L。按照實(shí)際可操作條件，將配方調(diào)整為葡萄糖136 g/L、NaNO33.8 g/L、MgSO40.4 g/L，胰蛋白胨7 g/L、KCl 0.5 g/L、K2HPO41.3 g/L和FeSO40.1 g/L。按照優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測得小核菌多糖產(chǎn)量實(shí)際值為（23.76±1.05）g/L，同初始培養(yǎng)基相比提高了54.42%，與預(yù)測值誤差為2.5%，可見該模型能夠較好的預(yù)測小核菌多糖的實(shí)際產(chǎn)值。

3 結(jié)論

通過對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究了提高齊整小核菌多糖產(chǎn)量的方案，依次通過單因素試驗(yàn)考察不同碳源、不同氮源和無機(jī)鹽對(duì)于齊整小核菌產(chǎn)多糖培養(yǎng)基的影響，并通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)等獲得最優(yōu)培養(yǎng)基配方。最終得到的小核菌多糖最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖136 g/L、NaNO33.8 g/L、MgSO40.4 g/L，胰蛋白胨7 g/L、KCl 0.5 g/L、K2HPO41.3 g/L和FeSO40.1 g/L，此培養(yǎng)基得到的多糖產(chǎn)量為（23.76±1.05）g/L，相比原始培養(yǎng)基提高54.42%。