高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

陳曉飛，李珊珊，刁文濤，徐紫瑜，劉德海*

（1.河南省科學(xué)院 生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450008；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

甘露聚糖是自然界中半纖維素的第二大組分[1]，普遍存在于植物性食品及動(dòng)物飼料中，它是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，在家禽和豬等單胃動(dòng)物體內(nèi)會(huì)形成凝膠，使消化道內(nèi)容物有很大的黏性，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[2-3]。β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanase）是一類水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖以及半乳葡萄甘露聚糖中β-1,4-D-吡喃甘露糖苷鍵的內(nèi)切酶[4-6]，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。β-甘露聚糖酶用于飼料工業(yè)，不僅可以消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子甘露聚糖，其水解產(chǎn)物甘露低聚糖還可以改善飼料營養(yǎng)、提高飼料利用率、促進(jìn)畜禽生長[7]，同時(shí)還能促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的增殖，抑制病原菌生長，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，顯著提高動(dòng)物免疫功能，減少飼料中抗生素等化學(xué)藥物的使用，從而減少養(yǎng)殖污染[8]。β-甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，微生物是其最主要的生產(chǎn)來源。雖然目前國內(nèi)外已有很多通過分子技術(shù)手段，使β-甘露聚糖酶異源表達(dá)水平大大提高的報(bào)道[9-10]，但現(xiàn)有的微生物β-甘露聚糖酶因生物安全性問題，限制了其在飼料生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用[11]，因此篩選更為安全的生產(chǎn)菌株，增加野生β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌的種質(zhì)資源至關(guān)重要。

本試驗(yàn)通過剛果紅平板初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩的方法，從不同地區(qū)的魔芋生產(chǎn)基地土壤中，篩選分離β-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株；通過形態(tài)學(xué)察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)的方法對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為β-甘露聚糖酶在飼料工業(yè)中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：采自河南省南陽西峽縣、河南省南陽西峽縣后塘溝村、云南省昆明市盤龍區(qū)新發(fā)村、福建省南平市政和縣天井洋村等地的魔芋生產(chǎn)基地。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、魔芋粉：北京索萊寶生物科技有限公司；甘露糖：麥克林生物技術(shù)有限公司；甘露聚糖：美國Sigma公司；瓊脂糖：北京鼑國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；API 50CHB、ZYM鑒定試劑盒：物梅里埃中國有限公司；DNA Marker、2×EsTaq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：北京酷來搏科技有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tec公司；細(xì)菌16SrDNA通用引物27F和1492R：深圳華大基因科技有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：魔芋精粉5 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 0.05 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。121 ℃滅菌15 min。

初篩分離培養(yǎng)基：魔芋精粉3 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母膏1 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.25 g/L，剛果紅0.5 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。121 ℃滅菌15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋精粉15g/L，蛋白胨8g/L，酵母膏4g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.25 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

K-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QYCAxioImageM2全自動(dòng)熒光顯微鏡：德國Zeiss公司；Thermoblock梯度電泳儀：德國Biometra公司；TCYQ全溫?fù)u瓶柜：太倉市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀：美國Thermo公司；DChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Biometra TGRADIENT聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Waterman公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株的篩選

取10 g土壤樣品于裝液量為100 mL/250 mL富集培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，將富集培養(yǎng)液用無菌水梯度稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5后，取100 μL涂布于初篩分離培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h后，記錄透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比（D/d），作為產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株能力的初篩標(biāo)準(zhǔn)。選用D/d值較大即產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，接入種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)18 h后，按3%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件搖床培養(yǎng)24 h，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，上清液即粗酶液，測(cè)定β-甘露聚糖酶酶活，復(fù)篩菌株。

1.3.2 分析檢測(cè)

β-甘露聚糖酶的酶活測(cè)定按照國標(biāo)GB/T 36861—2018《飼料添加劑β-甘露聚糖酶活力的測(cè)定分光光度法》[13]。β-甘露聚糖酶酶活定義：在37 ℃、pH值為5.5條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為3 mg/mL甘露聚糖溶液中釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)篩選分離純化的菌株進(jìn)行菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察，并進(jìn)行革蘭氏染色[12]。

生理生化鑒定：通過API 50CHB和ZYM鑒定試劑盒，對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基上，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜，采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物27F和1492R擴(kuò)增目標(biāo)菌株的16S rDNA序列。PCR反應(yīng)體系（30 μL）為：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，2×EsTaq酶15 μL，引物27F和1492R（20 μmol/L）各1 μL，無菌雙蒸水12 μL，混勻。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank基因庫中進(jìn)行基本局部比對(duì)工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索，選取同源性較高的已知菌種的16S rDNA序列，采用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

參考張建新等[14]的雙水相萃取法，在16%（NH4）2SO4、18%PEG2000和2%NaCl的雙水相體系條件下，對(duì)粗酶液進(jìn)行純化，純化后的酶液用于酶學(xué)性質(zhì)分析。

最適反應(yīng)pH值：采用不同緩沖體系配成一系列濃度0.1 mol/L的緩沖液，緩沖體系和pH值范圍分別為：甘氨酸-HCl緩沖液（pH 3.0）、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0、pH 5.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0、pH 10.0）。底物分別用上述不同pH值的緩沖液配制后，在pH 3.0～10.0反應(yīng)體系下，37 ℃條件下保溫30 min，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力。

pH值穩(wěn)定性：將酶液與不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）緩沖液混合，37 ℃保溫2 h后，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活。

最適溫度：在pH5.5、0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液體系中，在不同溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）條件下反應(yīng)30 min，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力。

溫度穩(wěn)定性：酶液在pH 5.5 0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液體系中，不同溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）條件下，保溫30 min，立即冰水浴冷卻，用未經(jīng)溫度處理的酶液作對(duì)照，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活。

金屬離子和乙二胺四乙酸（EDTA）對(duì)酶活力的影響：在酶反應(yīng)體系中，分別加入金屬離子（Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Li+、Ca2+、Co2+）和EDTA溶液（使終濃度為2.5 mmol/L），以未加金屬離子和螯合劑為對(duì)照，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定

2.1.1β-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株的分離篩選

通過平板初篩的方法，從不同地區(qū)魔芋生產(chǎn)基地的土壤中，共分離篩選得到32株在初篩平板上D/d值較大的菌株，其中6株有代表性的菌株在初篩平板上形成的透明圈見圖1。32株菌經(jīng)液體發(fā)酵24 h復(fù)篩后，上清液酶活見表1。由表1可知，分自河南省南陽西峽縣后塘溝村土壤樣品的菌株HTGC-10經(jīng)液體發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活力最高，可以達(dá)到61.75 U/mL，其產(chǎn)酶能力顯著高于現(xiàn)有報(bào)道的多數(shù)野生菌株[15-17]，且經(jīng)反復(fù)發(fā)酵后產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。因此，進(jìn)一步對(duì)菌株HTGC-10進(jìn)行鑒定。

圖1 6株代表性菌株在初篩平板上形成的透明圈Fig.1 Transparent circles formed by 6 representative strains on the primary screening plate

表1 32株分離菌株的β-甘露聚糖酶活力Table 1 β-mannanase activity of 32 isolated strains

2.1.2 高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株的鑒定

菌株HTGC-10的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖2。由圖2A可知，菌落呈圓形，無色半透明，表面光滑濕潤，邊緣整齊，將菌落挑起后有明顯拉絲現(xiàn)象。由圖2B可知，經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株HTGC-10產(chǎn)橢圓形芽孢，芽孢呈藍(lán)紫色，因此鑒定其為革蘭氏陽性菌。

圖2 菌株HTGC-10的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of strain HTGC-10

菌株HTGC-10的接觸酶反應(yīng)（contact enzyme reaction，ZYM）和可利用碳源（API 50CHB）試驗(yàn)結(jié)果分別見表2、表3。

表2 菌株HTGC-10的接觸酶反應(yīng)結(jié)果Table 2 Contact enzyme reaction results of strain HTGC-10

表3 菌株HTGC-10的碳源利用能力Table 3 Carbon source utilization capacity of strain HTGC-10

菌株HTGC-10的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株HTGC-10在1 500 bp附近有明顯條帶，經(jīng)過測(cè)序，菌株HTGC-10的16S rDNA序列長度為1 493 bp。

圖3 菌株HTGC-10的16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of 16S rDNA polymerase chain reaction amplification products of strain HTGC-10

菌株HTGC-10的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，菌株HTGC-10與Bacillus amyloliquefaciens的相似度最高，結(jié)合菌株HTGC-10的菌落形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)結(jié)果和16SrDNA分析，該菌株被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖4 基于16S rDNA序列菌株HTGC-10的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain HTGC-10 based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株HTGC-10產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 pH值對(duì)酶活力的影響

pH值對(duì)甘露聚糖酶活力的影響見圖5。由圖5可知，在pH3.0～6.0時(shí)，隨著pH值的升高，酶活力迅速升高，并在pH值為6.0時(shí)其酶活達(dá)到最高，為54.94 U/mL；而在pH 6.0～10.0時(shí)，酶活力隨著pH值的升高則逐漸下降，在pH10.0時(shí)的酶活力僅為pH 6.0時(shí)的2.7%，說明該酶適合在弱酸性的條件下發(fā)揮作用。因此，菌株HTGC-10產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為6.0，偏酸性，這與已報(bào)道[18-20]的芽孢菌產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)相似。

圖5 反應(yīng)pH值對(duì)β-甘露聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction pH value on β-mannanase activity

2.2.2 溫度對(duì)酶活力的影響

不同反應(yīng)溫度對(duì)β-甘露聚糖酶活力的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在30～55 ℃時(shí)，隨溫度的升高，酶活力逐漸升高，并在溫度55 ℃時(shí)β-甘露聚糖酶達(dá)到最高，為84.97 U/mL；而當(dāng)反應(yīng)溫度＞55 ℃之后，酶活力隨溫度的升高迅速下降，70 ℃時(shí)的酶活力僅為55 ℃的15.1%。因此，菌株HTGC-10產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，這與黃俊麗等[11]篩選的假單胞菌產(chǎn)生的酶的最適反應(yīng)溫度相似。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)β-甘露聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on β-mannanase activity

2.2.3β-甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性

將酶液與不同pH緩沖液混合，37 ℃保溫2 h后，剩余β-甘露聚糖酶活性見圖7。由圖7可知，在pH 3.0、5.0～9.0保溫后，剩余相對(duì)酶活力均在60%以上，表明酶在該pH范圍內(nèi)時(shí)，活性相對(duì)穩(wěn)定，但當(dāng)pH值等于4.0或大于9.0 時(shí)，酶活力迅速下降，相對(duì)酶活力均在5%以下，說明該酶偏堿性條件耐受性較差；這里比較特殊的是，在pH4.0保溫2 h后，出現(xiàn)了大量沉淀，酶活力只有最高活力的3.9%，這可能與酶的等電點(diǎn)有關(guān)，該觀點(diǎn)需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

圖7 pH值對(duì)β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH value on β-mannanase stability

2.2.4β-甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響見圖8。由圖8可知，該酶在40 ℃相對(duì)穩(wěn)定，保溫30 min后剩余酶活力為原酶活力的82.1%，但隨著溫度的升高，酶活力迅速下降，在45 ℃條件下保溫30 min后，活力為原酶活力的24.3%，后隨著溫度的升高，酶活力繼續(xù)下降，在溫度達(dá)到55 ℃以上保溫30 min后，β-甘露聚糖酶幾乎已經(jīng)完全失活。由此可知，本試驗(yàn)篩選菌株HTGC-10產(chǎn)β-甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性相對(duì)較差。

圖8 溫度對(duì)β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on the β-mannanase stability

2.2.5 金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響

金屬離子和EDTA對(duì)酶活性的影響見圖9。由圖9可知，EDTA對(duì)酶活有顯著的抑制作用，與對(duì)照組相比，酶活力下降了24.3%；金屬離子Li+和Co2+對(duì)酶活力基本沒有影響；其余金屬離子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+對(duì)酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+對(duì)酶活力的抑制作用最顯著，加入Cu2+后，酶活力僅為對(duì)照組酶活力的11.9%，這與張建新等[14]報(bào)道的Cu2+對(duì)枯草芽孢桿菌YZ-21產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶活性有顯著抑制作用相似。

圖9 乙二胺四乙酸和金屬離子對(duì)β-甘露聚糖酶活力的影響Fig.9 Effect of ethylene diamine tetraacetic acid and mental ions on β-mannanase activity

3 結(jié)論

本試驗(yàn)經(jīng)過平板初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩的方法，從不同地區(qū)的魔芋生產(chǎn)基地采集的土壤樣品中，篩選出一株高產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性菌株HTGC-10，該菌株液體發(fā)酵24 h后，β-甘露聚糖酶活力可以達(dá)到61.75 U/mL；經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、ZYM和API 50CHB生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析，鑒定菌株HTGC-10為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10所產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為6.0，具有較強(qiáng)的pH值耐受能力，最適反應(yīng)溫度為55 ℃，熱穩(wěn)定性相對(duì)較差；EDTA和金屬離子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+對(duì)酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+對(duì)酶活力的抑制作用最顯著。菌株HTGC-10具有較好的產(chǎn)β-甘露聚糖酶能力，有一定的開發(fā)利用價(jià)值。