花生粕醬油制曲工藝條件優(yōu)化

張 超，李玟君，汪海燕，李玉蝶，汪 超，李 瑋*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430060）

傳統(tǒng)釀造醬油最常用的蛋白原料是大豆，其蛋白質(zhì)含量為30%～40%[1]，但是我國的大豆主要依賴于進(jìn)口，據(jù)統(tǒng)計(jì)2020年我國大豆進(jìn)口量高達(dá)10 032.73萬t，進(jìn)而使用大豆為蛋白原料生產(chǎn)的醬油等調(diào)味品的成本也隨之增加[2-3]，因此尋找優(yōu)質(zhì)價(jià)廉的蛋白源替代大豆蛋白，探索新型醬油調(diào)味品的釀造工藝成為解決國計(jì)民生問題的關(guān)鍵突破口。

花生粕是花生果仁經(jīng)油脂提取后的副產(chǎn)物，其主要營養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)的含量為30%以上，氨基酸含量約為40%，含有多種維生素和黃酮類物質(zhì)，且不含膽固醇[4]?；ㄉ山?jīng)微生物分解后會(huì)產(chǎn)生酸甜的芳香氣味，是用來釀造醬油的良好蛋白原料。但是目前花生粕主要被用作肥料和動(dòng)物飼料，造成花生蛋白資源的浪費(fèi)[5]。近年來，隨著對花生粕的研究不斷深入，以花生粕為原料釀造醬油也在陸續(xù)進(jìn)行中，在2014年，成曉苑等[6]對花生粕醬油進(jìn)行了研究，得到的醬油蛋白質(zhì)消化率得到了顯著提高。但在實(shí)際醬油生產(chǎn)中，花生粕仍然沒有得到很好的推廣[7-9]。

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化制曲工藝，研究了花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比、米曲霉接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間4個(gè)因素對花生粕醬油成曲中性蛋白酶活的影響，確定最佳制曲條件，并對成曲的酸性蛋白酶活、糖化酶活和纖維素酶活進(jìn)行了測定，為花生醬油的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕[蛋白質(zhì)含量（34.58±0.046）%、水分含量＜3%）]、小麥麩皮（水分含量＜12%）：市售；米曲霉（Aspergillusoryzae）As3.042：山東和眾康源生物科技有限公司；酪氨酸（分析純）：德國BioFroxx公司；三氯乙酸（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；干酪素（分析純）：美國Sigma公司；福林酚（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、羧甲基纖維素鈉、碘、碘化鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-SG41-280-B高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)療核子儀器廠；Vortex-Genie2渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器（試驗(yàn)）有限公司；AB-50電子分析天平：瑞士Mette公司；GNP-9160BS-Ⅲ恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造公司；WFJ2000紫外可見分光光度計(jì)：上海龍尼柯儀器設(shè)備有限公司；MB25水分測定儀：奧豪斯儀器（常州）有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生粕曲料的制備

參照劉晶晶[10]的制曲方法，稍作修改。具體如下：將花生粕粉碎、潤水、蒸煮、冷卻后與小麥麩皮按一定比例充分混勻，加入米曲霉As3.042，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，進(jìn)行第一次翻曲，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后進(jìn)行第二次翻曲，共培養(yǎng)24 h即得到成曲。

1.3.2 樣品粗酶液的提取

準(zhǔn)確稱取5 g成曲樣品，充分研磨，加入pH7.2磷酸鹽緩沖溶液60 mL，放入40 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸提1 h，期間攪拌3～4次。浸提完畢后，用中性緩沖溶劑定容至100 mL，過濾，所得濾液即為粗酶液[11]。此過程中需同時(shí)測定曲料中的水分含量、蛋白酶酶活、糖化酶酶活、纖維素酶酶活。

蛋白酶酶活定義為：在40 ℃的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/g）；纖維素酶酶活定義為：在40 ℃、pH 5.0的條件下，每分鐘從4 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/g）；糖化酶酶活定義為：在40 ℃、pH 5.0的條件下，每分鐘生成1 mg葡萄糖的酶量一個(gè)糖化酶活力單位（U/g）。

1.3.3 分析檢測

蛋白酶活的測定：參考鄭東影等[12]的方法；糖化酶酶活、淀粉酶酶活、纖維素酶酶活的測定：參考冷云偉[13]的方法；水分含量的測定：參考蘇永健[14]的方法；蛋白質(zhì)的測定：參考國標(biāo)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

1.3.4 制曲工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

花生粕蒸煮出鍋后，冷卻，在無菌條件下與小麥麩皮、米曲霉混合均勻，恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間后，檢測其成曲的中性蛋白酶活。分別考察花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）、米曲霉接種量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、制曲溫度（27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃）、制曲時(shí)間（20 h、24 h、28 h、32 h、36 h）對花生粕成曲的中性蛋白酶酶活的影響。

1.3.5 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)[15]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比（A）、制曲時(shí)間（B）、制曲溫度（C）、米曲霉接種量（D）4個(gè)因素為自變量、以中性蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，得到最優(yōu)制曲工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests design for koji-making process optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用Origin 9.6、Excel 2019、Design-Expert 8.0.6和SPSS22.0等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每個(gè)處理組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比的選擇

在醬油發(fā)酵中，蛋白原料決定了氨基酸含量的高低[16]。花生粕可作為發(fā)酵底物的主要成分，而小麥麩皮的多少影響了醬油風(fēng)味物質(zhì)的好壞，因此制曲過程中，二者的比例關(guān)系決定了成品醬油的品質(zhì)?；ㄉ膳c小麥麩皮質(zhì)量比對成曲中性蛋白酶活的影響結(jié)果見圖1。

圖1 花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比對成曲中性蛋白酶活的影響Fig.1 Effect of peanut meal and wheat bran mass ratio on neutral protease activity of koji

由圖1可知，原料質(zhì)量比確實(shí)對米曲霉產(chǎn)生的中性蛋白酶有一定的影響。在一定范圍內(nèi)隨著花生粕與小麥麩皮添加比例的不同，對成曲的中性蛋白酶活造成了影響。當(dāng)花生粕與小麥麩皮的質(zhì)量比為8∶2時(shí)，中性蛋白酶活達(dá)到了最大值，為（1 397.97±30.57）U/g。這是因?yàn)榛ㄉ珊托←滬熎さ奶砑颖壤煌?，造成了米曲霉生長環(huán)境發(fā)生了變化，在曲料中花生粕主要為米曲霉提供生長所需的蛋白質(zhì)原料，而小麥麩皮主要為米曲霉提供生長所需的淀粉質(zhì)原料。一般情況下，花生蛋白含量大于淀粉質(zhì)原料時(shí)，有利于米曲霉自身進(jìn)行呼吸作用，將花生蛋白分解成氨基酸，而使整個(gè)制曲環(huán)境中含有大量的氨基，呈現(xiàn)出較高的pH環(huán)境，則有利于中性蛋白酶的積累[17]；隨著淀粉質(zhì)原料的增加，花生蛋白的含量逐漸減少，米曲霉進(jìn)行呼吸作用時(shí)優(yōu)先選擇淀粉質(zhì)原料為營養(yǎng)物質(zhì)，則呼吸作用就不會(huì)使制曲環(huán)境呈現(xiàn)出較高的蛋白質(zhì)含量，此時(shí)的中性蛋白酶活就會(huì)減少。因此，最佳花生粕與小麥麩皮的質(zhì)量比為8∶2。

2.1.2 米曲霉接種量對花生粕成曲的中性蛋白酶酶活的影響

我國醬油制曲中所用的微生物主要是米曲霉，其中米曲霉As3.042是我國醬油生產(chǎn)廠主要使用的發(fā)酵菌種，具有生產(chǎn)周期短、抗性好、生長快等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。米曲霉接種量對成曲中性蛋白酶活的影響結(jié)果見圖2。

圖2 米曲霉接種量對成曲中性蛋白酶活的影響Fig.2 Effect of Aspergillus oryzae inoculum on neutral protease activity of koji

由圖2可知，米曲霉As3.042接種量在0.3%～0.6%時(shí)，中性蛋白酶酶活隨著米曲霉As3.042接種量的增加而增高；當(dāng)米曲霉As3.042接種量為0.6%時(shí)，中性蛋白酶酶活達(dá)到了最大，為（1 414.49±30.97）U/g；當(dāng)米曲霉As3.042接種量＞0.6%之后，中性蛋白酶活呈下降趨勢。原因可能是前期米曲霉接種量較少，米曲霉無法在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，使其分解蛋白質(zhì)的能力下降，制曲底物的營養(yǎng)過剩，造成浪費(fèi)；隨著米曲霉接種量的增大，制曲的基料無法滿足大量米曲霉成長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致個(gè)體生長狀況不佳，影響米曲霉孢子的成熟，最終使成曲的蛋白酶活力下降[20-22]。因此，選擇最佳米曲霉As3.042的接種量為0.6%。

2.1.3 制曲溫度對花生粕成曲的中性蛋白酶酶活的影響

溫度的控制在制曲工序中尤為重要，制曲溫度對成曲中性蛋白酶活的影響結(jié)果見圖3。

圖3 制曲溫度對成曲中性蛋白酶活的影響Fig.3 Effect of koji-making temperature on neutral protease activity of koji

由圖3可知，隨著制曲溫度在27～33 ℃范圍內(nèi)的升高，蛋白酶活性逐漸增強(qiáng)；制曲溫度為33 ℃時(shí)，中性蛋白酶活最大值，為（1 654.47±25.34）U/g；制曲溫度＞33 ℃之后，蛋白酶酶活開始下降。研究表明，米曲霉As3.042最適的生長溫度在30～35 ℃[23]，當(dāng)溫度較低時(shí)，米曲霉發(fā)芽緩慢，蛋白酶活會(huì)受到抑制，容易滋生其他細(xì)菌，導(dǎo)致曲料變酸；當(dāng)溫度過高時(shí)，曲料中水分損失加快，早期制曲階段便會(huì)發(fā)干，水分活度太低，酶活性下降，容易出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象[24-25]。因此，最佳制曲溫度為33 ℃。

2.1.4 制曲時(shí)間對花生粕成曲的中性蛋白酶酶活的影響

制曲時(shí)間對成曲中性蛋白酶活的影響結(jié)果見圖4。

圖4 制曲時(shí)間對成曲中性蛋白酶活的影響Fig.4 Effect of koji-making time on neutral protease activity of koji

由圖4可知，花生粕醬油曲料在制曲時(shí)間20～24 h期間，中性蛋白酶活力隨制曲時(shí)間延長而增高；在制曲時(shí)間為24 h時(shí)，曲料的中性蛋白酶活力達(dá)到了最大，為（1 925.85±39.34）U/g；制曲時(shí)間＞24 h之后，曲料的中性蛋白酶活力有所下降。這是因?yàn)橹魄鷷r(shí)間較短時(shí)，霉菌不能充分生長，菌絲無法深入到原料中將其分解，降低了原料利用率[26]；繼續(xù)延長制曲時(shí)間，可能增加感染雜菌的幾率，且長時(shí)間的培養(yǎng)，曲料中的營養(yǎng)底物和水分含量在不斷減少，使米曲霉的生長受阻，曲料發(fā)干，最終對蛋白酶活造成影響[27]。因此，最佳制曲時(shí)間為24 h。

2.2 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比（A）、制曲時(shí)間（B）、制曲溫度（C）、接種量（D）為自變量，以成曲中性蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行多次擬合回歸分析，可得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=2333.91+114.15A-76.89B-602.20C+139.17D+16.92AB-60.35AC+17.77AD+15.00BC+64.28BD+175.03CD-439.56A2-262.54B2-738.62C2-460.94D2

由表3可知，失擬項(xiàng)P值=0.080 3＞0.05，不顯著，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象；而模型P值＜0.000 1，表明建立的模型是高度顯著的，由此得出該模型的預(yù)測值與實(shí)際值比較相符，試驗(yàn)結(jié)果可靠。由P值可以看出，一次項(xiàng)A、D，交互項(xiàng)CD，二次項(xiàng)B2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)A2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。各因素對花生醬油制曲條件的影響依次為：制曲溫度＞接種量＞花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比＞制曲時(shí)間。

由圖5可知，制曲溫度與接種量之間交互作用顯著，原料質(zhì)量比與制曲溫度、制曲溫度與制曲時(shí)間、接種量與原料質(zhì)量比、制曲時(shí)間與接種量、原料質(zhì)量比與制曲時(shí)間之間交互作用不顯著。通過響應(yīng)面的坡度陡峭程度可以看出，制曲溫度影響最大，其次是接種量、原料質(zhì)量比、制曲時(shí)間，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對成曲中性蛋白酶酶活影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on neutral protease activity of koji

根據(jù)建立的模型優(yōu)化后的工藝條件為花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比8.3∶1.7、米曲霉接種量0.63%、制曲時(shí)間23.7 h、制曲溫度31.7 ℃。在此條件下，中性蛋白酶活力預(yù)測值為2 443.79 U/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的可行性，將驗(yàn)證條件修正為花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比8∶2、米曲霉接種量0.65%、制曲時(shí)間24 h、制曲溫度32 ℃。在此優(yōu)化制曲工藝條件下，成曲的中性蛋白酶活實(shí)際值為（2 493.67±7.70）U/g，與預(yù)測值基本一致，表明所建模型預(yù)測花生醬油成曲的中性蛋白酶活是準(zhǔn)確可行的。

2.3 工藝優(yōu)化后花生粕成曲酶活力的檢測

米曲霉是醬油發(fā)酵過程中起關(guān)鍵性作用的菌株，確保各種活性酶類的生成[28-29]。其中蛋白酶可將蛋白質(zhì)分解成游離氨基酸、多肽和小分子短肽等，在醬油風(fēng)味品質(zhì)的形成上影響重要[30-32]；糖化酶、淀粉酶可促進(jìn)碳水化合物的水解、釋放，生成小分子多糖、單糖等，影響醬油糖類物質(zhì)的組成和美拉德反應(yīng)，進(jìn)而影響醬油的滋味和香氣[33-35]；纖維素酶可以降解醬油原料的植物性細(xì)胞壁，提高蛋白質(zhì)和碳水化合物酶類的效率，提高澄清性[36-37]。因此，按照優(yōu)化后的制曲工藝，對花生粕成曲的酸性蛋白酶活、糖化酶活、淀粉酶活和纖維素酶活進(jìn)行了測定，結(jié)果見表4。由表4可知，4種酶活與傳統(tǒng)醬油蛋白原料的酶活相近[38-40]。

表4 優(yōu)化工藝后花生粕成曲的酶活Table 4 Enzyme activity of peanut meal koji after process optimization

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以花生粕和小麥麩皮為原料，利用傳統(tǒng)醬油制曲工藝，對花生醬油制曲階段的原料質(zhì)量比、米曲霉接種量、制曲時(shí)間和制曲溫度進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到了花生粕醬油制曲工藝最佳條件為：花生粕與小麥麩皮質(zhì)量比8∶2、米曲霉As3.042接種量0.65%、制曲時(shí)間24 h、制曲溫度32 ℃。此優(yōu)化制曲工藝條件下，中性蛋白酶活（2 493.67±7.70）U/g、酸性蛋白酶活（596.84±23.12）U/g、糖化酶活（29.91±2.63）U/g、淀粉酶活（882.85±32.63）U/g、纖維素酶活（11.72±3.69）U/g。結(jié)果表明，用花生粕代替?zhèn)鹘y(tǒng)醬油制曲的蛋白質(zhì)原料是可行的，這為制取花生醬油提供了基礎(chǔ)，擴(kuò)展了花生粕的利用途徑。