骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)腎動(dòng)脈移植對(duì)阿霉素慢性腎病大鼠腎臟炎癥的影響

李天祎， 楊 揚(yáng)， 萬(wàn)珊杉， 楊素萍， 李嘉琦， 王家平

慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)生率近年來(lái)逐漸增高，我國(guó)約有成年患者1.2 億，患病率高達(dá)10.8%，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也越來(lái)越重［1］。 多項(xiàng)研究表明腎臟免疫介導(dǎo)性炎癥是CKD 重要致病因素之一。 目前CKD 治療手段有限， 僅能延緩腎衰竭進(jìn)展，達(dá)不到根治目的，尋找特異性治療方法成為亟待解決的問(wèn)題［2］。 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與再生醫(yī)學(xué)不斷興起，為治療提供了新思路。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）作為再生醫(yī)學(xué)源于中胚層的未分化成體干細(xì)胞，具有定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等潛在能力，并可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新毛細(xì)血管形成和抑制炎性反應(yīng)、刺激內(nèi)源性再生等，減輕腎損傷并促進(jìn)受損腎組織重構(gòu)［3］。 目前，BMSC 主要通過(guò)尾靜脈和腎動(dòng)脈移植，不同移植方法會(huì)對(duì)BMSC 歸巢數(shù)量產(chǎn)生影響，對(duì)腎組織修復(fù)效果也會(huì)產(chǎn)生差異。 本研究旨在評(píng)價(jià)經(jīng)腎動(dòng)脈移植BMSC，對(duì)阿霉素CKD大鼠受損腎臟的修復(fù)作用及對(duì)腎臟炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

37 只健康清潔級(jí)16 周齡雄性Sprague- Dawley（SD）大鼠（購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量250～300 g，其中2 只4 周齡，用于分離BMSC。胎牛血清（FBS）、低糖培養(yǎng)基（L- DMEM）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，阿霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，肝素由實(shí)驗(yàn)室配置，蘇木精- 伊紅（HE）染色試劑盒、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（EDTA）消化液購(gòu)自北京索萊寶科技公司，CD3、CD20 單體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 BMSC 分離和培養(yǎng)

2 只4 周齡大鼠脫頸處死， 置于75%乙醇溶液中浸泡10 min，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈， 于超凈臺(tái)下分離雙側(cè)脛骨和股骨，剪去兩側(cè)骨骺端，磷酸緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔3～5 次，至其變白；將骨髓腔沖洗液置于離心管， 充分吹打混勻后用100 μm細(xì)胞篩過(guò)濾，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用含有10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的L- DMEM 重懸細(xì)胞， 再次吹打均勻后制成單細(xì)胞懸液， 接種至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；48 h 后首次換液并每間歇3 d 換液1 次；待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)75%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化細(xì)胞，按1︰4 傳代。 取P3 代細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原。

1.3 模型制作和分組

大鼠置于鼠籠，自由飲食飲水1 周。 取24 只制作CKD 動(dòng)物模型： 全身麻醉后俯臥位固定于超凈臺(tái)，逐層切開(kāi)左側(cè)肋脊角皮膚和肌肉，暴露左腎，結(jié)扎左腎蒂后切除左腎， 待大鼠自然清醒后以3 mg/kg阿霉素經(jīng)尾靜脈注射，并于1 周后取同等劑量阿霉素再次注射，術(shù)后每周經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈取血檢測(cè)腎功能。 參考陸發(fā)承等方法［4］，以血紅蛋白減少，血肌酐、尿素氮升高為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。 造模過(guò)程中，3 只鼠因失血過(guò)多死亡，另隨機(jī)選取3 只造模后補(bǔ)充。 將造模成功大鼠隨機(jī)分為CKD 組、經(jīng)腎動(dòng)脈移植BMSC組（A 組）和經(jīng)尾靜脈移植BMSC 組（V 組），每組8只；余8 只健康大鼠為正常對(duì)照組（N 組），經(jīng)尾靜脈輸注等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 不同途徑移植BMSC

將BMSC 用0.25%胰蛋白酶- EDTA 消化，含10%FBS L-DMEM 培養(yǎng)基終止消化后以1 500 r/min離心，棄上清液，PBS 重懸細(xì)胞，充分吹打混勻制成2×106個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，冰盒保存?zhèn)溆谩?A 組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后仰臥固定，參考趙桂峰等［5］方法，選擇左頸部距頸正中線約0.5 cm 處， 聚維酮碘備皮消毒鋪巾后暴露頸部，于正中作一約2.0 cm 縱行切口； 逐層分離皮膚、肌肉組織，充分暴露視野，頓性分離左頸總動(dòng)脈，眼科剪作T 形切口， 將無(wú)菌PE10 導(dǎo)管頭斜形剪切塑形后，DSA 動(dòng)態(tài)觀察下向足側(cè)推送至右腎動(dòng)脈開(kāi)口處，同時(shí)間推注肝素；注射少量對(duì)比劑確定導(dǎo)管在腎動(dòng)脈，推注500 μL BMSC 懸液，結(jié)扎左頸總動(dòng)脈后逐層縫合手術(shù)切口；術(shù)后肌內(nèi)注射抗生素預(yù)防感染，將大鼠置于保溫箱中密切觀察，待其自然清醒后歸籠繼續(xù)飼養(yǎng)。 V 組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量BMSC 懸液。CKD 組經(jīng)尾靜脈注射等量PBS 溶液。N組經(jīng)尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

觀察指標(biāo)為血肌酐、 血尿素氮及24 h 尿蛋白，腎臟病理切片HE 染色觀察病理改變情況。 分別于移植BMSC 后7、14 d， 將各組大鼠放入代謝籠內(nèi)，收集24 h 尿液，尾靜脈采血分離血清，Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h 尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平。 14 d 末處死各組大鼠，取腎組織，固定、脫水后制成5 μm 石蠟切片，HE 染色觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組化染色觀察CD3、CD20 浸潤(rùn)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多變量重復(fù)測(cè)量資料用方差分析， 兩兩比較用最小顯著性差異（LSD）-t 驗(yàn)檢，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

大鼠BMSC 分離、純化、鑒定結(jié)果顯示，倒置相差顯微鏡下BMSC 呈梭形， 魚群狀或旋渦狀貼壁生長(zhǎng)；P4 代BMSC 表面抗原CD11b、CD45、CD29、CD90 表達(dá)率，分別為2.23%、1.94%、99.98%、99.97%，見(jiàn)圖1。

圖1 P4 代大鼠BMSC(×20)

N 組大鼠毛色光澤，精神良好；CKD 組、A 組、V組大鼠精神萎靡，毛色微黃，進(jìn)食量、體質(zhì)量減少，部分大鼠伴發(fā)腹水。 BMSC 移植治療結(jié)果顯示，CKD組、A 組、V 組與N 組相比，BMSC 移植后血肌酐、血尿素氮和24 h 尿蛋白均顯著升高（P＜0.01）。 移植后7、14 d，V 組、A 組血肌酐均較CKD 組降低（P＜0.01），A 組在7 d 時(shí)下降更為顯著（P＜0.01）；移植后7 d，V 組、A 組血尿素氮較CKD 組均顯著下降（P＜0.01），A 組變化更為顯著（P＜0.01），移植后14 d，V 組、A組較CKD 組稍降低，A 組變化更為顯著（P＜0.01）；移植后7、14 d，V 組、A 組24 h 尿蛋白較CKD 組均顯著降低（P＜0.01），A 組下降更為顯著（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 BMSC 移植后各組大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h 尿蛋白比較

免疫組化觀察結(jié)果顯示，N 組大鼠CD3、CD20表達(dá)為陰性；CKD 組大鼠CD3 在大量腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，CD20 在腎間質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)， 在部分腎小球中呈陽(yáng)性表達(dá)；A 組、V 組大鼠腎間質(zhì)CD3、CD20 表達(dá)較CKD組減輕，但A 組較V 組減輕更為明顯，見(jiàn)圖2。 大鼠腎臟病理結(jié)果顯示，N 組可見(jiàn)正常腎小球，腎小球血管襻薄而清晰， 周圍腎小管正常；CKD 組腎小球出現(xiàn)萎縮，硬化，局部腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張淤血，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂， 部分上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變性，腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，且腎間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；A組、V 組腎臟近曲、遠(yuǎn)曲小管、髓襻和集合管上皮可見(jiàn)不同程度水腫變性，部分管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)可見(jiàn)少量透明管型，部分腎小球有輕微萎縮，腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量輕- 中度淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)的炎性反應(yīng)，A 組病理形態(tài)學(xué)變化較V 組更為輕微，見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠CD3、CD20 免疫組化染色結(jié)果(×200)

圖3 各組大鼠腎組織HE 染色結(jié)果(×20)

3 討論

CKD 在臨床上主要表現(xiàn)為高血壓、水腫、血尿、蛋白尿等，并會(huì)對(duì)腎組織造成不可逆損傷。 隨著發(fā)病率逐年上升及治療手段局限性，CKD 成為增長(zhǎng)最快、導(dǎo)致死亡的第三大慢性疾?。?-7］。 目前CKD 模型制作方法有很多， 例如5/6 腎臟切除＋阿霉素誘導(dǎo)法、單側(cè)輸尿管結(jié)扎法、腺嘌呤誘導(dǎo)法等。 本實(shí)驗(yàn)采用較為公認(rèn)的單側(cè)腎臟切除＋尾靜脈注射阿霉素法制作CKD 模型。 阿霉素常用于多種癌癥治療，對(duì)心臟、肝臟、骨髓、胃腸等有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，但經(jīng)大鼠尾靜脈注射后，其不良反應(yīng)主要累及腎臟［8］。 單側(cè)腎臟切除后，余腎代謝負(fù)荷加重，代償不足，再加上阿霉素不良反應(yīng)，呈現(xiàn)出腎功能惡化，并在病理上表現(xiàn)為腎小球萎縮、硬化，球囊粘連，局部腎小球毛細(xì)血管襻擴(kuò)張淤血等， 更加符合慢性腎衰竭表現(xiàn)。隨著對(duì)CKD 研究深入， 逐漸發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與腎臟免疫介導(dǎo)炎癥密切相關(guān)。 有文獻(xiàn)報(bào)道，T 淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞自身反應(yīng)導(dǎo)致的免疫穩(wěn)態(tài)破壞， 可能使CKD 炎性反應(yīng)發(fā)生在不同部位［9-10］。 T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是促發(fā)腎小球和腎間質(zhì)炎癥的主要原因， 可與樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用并加重腎小管損傷，而CD3 是T 淋巴細(xì)胞特異性表面抗原，且在腎組織中表達(dá)程度與腎損害嚴(yán)重程度保持一致，一定程度上可作為評(píng)估腎臟損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。 此外，CKD 持續(xù)性炎性反應(yīng)與B 淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)，且有研究證明抗CD20 單克隆蛋白（利妥昔單抗）可啟動(dòng)B 細(xì)胞免疫溶解過(guò)程， 靶向性殺傷B 細(xì)胞，阻斷其對(duì)腎組織的損傷［11］，這一結(jié)果證實(shí)CD20 可作為B 淋巴細(xì)胞特異性抗原參與CKD 炎性反應(yīng)［12］。因此， 可通過(guò)觀察CD3、CD20 在腎組織中浸潤(rùn)情況，判斷腎損傷嚴(yán)重程度。

近年來(lái)多項(xiàng)研究表明BMSC 具有修復(fù)損傷腎組織的能力，但具體修復(fù)機(jī)制仍不明確。Aghajani-Nargesi 等［13］研究顯示，BMSC 可通過(guò)與多種免疫細(xì)胞相互作用達(dá)到抑制炎性反應(yīng)的目的。Lindoso 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 可過(guò)表達(dá)CXCR4 受體或絲氨酸蛋白酶激肽釋放酶改善腎功能，并增強(qiáng)腎損傷中抗炎作用。 多項(xiàng)研究證明上述結(jié)論，BMSC 具有改善腎小球?yàn)V過(guò)率、減輕細(xì)胞衰老和炎性反應(yīng)并增加細(xì)胞增殖的作用［15］。 然而治療過(guò)程中如何提高BMSC 歸巢率和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率是亟待解決的問(wèn)題。 白彝華等［16］經(jīng)腎動(dòng)脈移植BMSC 治療CKD 大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎動(dòng)脈移植組24 h 尿蛋白和尿微量蛋白下降程度與尾靜脈移植組相比更為明顯，提示經(jīng)腎動(dòng)脈移植BMSC 對(duì)CKD 受損腎組織修復(fù)效果更佳。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比腎動(dòng)脈和尾靜脈兩種途徑移植BMSC 治療CKD 大鼠發(fā)現(xiàn)， 兩種途徑對(duì)受損腎組織均起到修復(fù)作用。 BMSC 移植后7 d，V 組、A 組與CKD 組相比，24 h 尿蛋白均顯著降低（P＜0.01），直至14 d 末A 組血肌酐、血尿素氮與V 組、CKD 組相比下降顯著（P＜0.01），證明BMSC 經(jīng)腎動(dòng)脈移植的效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈移植；免疫組化染色結(jié)果也顯示，CKD 組、A 組、V 組CD3、CD20 均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，A 組表達(dá)較V 組減弱；此外，A 組、V 組炎性浸潤(rùn)均較CKD 組減輕， 其中A 組腎小管和腎間質(zhì)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，萎縮的腎小球數(shù)量減少，腎小管擴(kuò)張情況得到改善。 綜合以上結(jié)果可得出結(jié)論，BMSC 可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)達(dá)到修復(fù)CKD 腎組織損傷的目的， 觀察時(shí)限內(nèi)經(jīng)腎動(dòng)脈移植效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈移植。

總之，BMSC 通過(guò)抑制免疫介導(dǎo)性炎癥修復(fù)受損腎臟組織，觀察時(shí)限內(nèi)經(jīng)腎動(dòng)脈途徑移植效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑移植。 本實(shí)驗(yàn)不足在于，未對(duì)炎性因子浸潤(rùn)進(jìn)行定量分析，BMSC 抑制腎臟炎癥的具體機(jī)制尚不明朗，而經(jīng)腎動(dòng)脈移植BMSC 修復(fù)受損腎組織的效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈移植的原因可能與BMSC 歸巢數(shù)量有關(guān)， 但BMSC 歸巢數(shù)未加檢測(cè)。BMSC 通過(guò)何種信號(hào)通路介導(dǎo)炎性反應(yīng)及BMSC 歸巢的影響因素等，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。