小麥赤霉病新抗源的發(fā)掘與抗性位點的檢測分析

翟文玲，劉彩云，劉穎，付必勝，蔡瑾，郭煒，張巧鳳，吳紀(jì)中

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室，南京210014

小麥赤霉?。‵usarium head blight，F(xiàn)HB）是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）引起的世界性小麥重要穗部真菌病害，其發(fā)生不僅嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和面粉品質(zhì)，而且能產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等毒素，嚴(yán)重危害人畜健康[1]。在我國，小麥赤霉病正從長江中下游冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)等常發(fā)、重發(fā)區(qū)域向黃淮麥區(qū)、北方麥區(qū)等擴(kuò)展[2-3]。除長江中下游麥區(qū)外，我國大部分麥區(qū)主栽品種赤霉病抗性較差。與化學(xué)防治相比，培育和推廣抗病品種是防治小麥赤霉病最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)境友好的途徑。

目前，全世界約有7萬份普通小麥及其近緣種屬種質(zhì)在人工接種或自然發(fā)病條件下被鑒定，約7 000份種質(zhì)呈現(xiàn)不同程度的赤霉病抗性[4]。我國歷時10余年，篩選出抗性強(qiáng)而穩(wěn)定的著名抗性資源蘇麥3號、望水白及穩(wěn)定中抗種質(zhì)溫州紅和尚、翻山小麥等[5]。美國鑒定出Haynes Bluestem、Preston、Glyndon Fife等中抗品種[6-9]。此外，韓國品種Chokwang[10]、日本品種Nyu Bai[11]、CIMMYT人工合成小麥[12]、阿根廷品種Barletta、瑞士品種Arina[13]、智利品種Praag 8[14]及巴西品種Polyssu、Encruzilhada、Toropi和Frontana[15]也被報道具有不同程度的赤霉病抗性。除普通小麥外，二倍體和四倍體小麥、偃麥草、大賴草、披堿草、纖毛鵝觀草、鵝觀草、新麥草、黑麥等小麥近緣種屬中均存在一些抗赤霉病資源[16-21]。

小麥赤霉病抗性是多基因控制的數(shù)量性狀，目前已經(jīng)從普通小麥及其近緣種屬中定位了約432個赤霉病抗性位點，覆蓋小麥21條染色體上44個染色體區(qū)段[4]。已命名的抗赤霉病基因或位點有Fhb1～Fhb7[[22-29]。其中，F(xiàn)hb1[30-31]和Fhb7[32]已經(jīng)被克隆。由于Fhb1在不同環(huán)境和遺傳背景能夠穩(wěn)定發(fā)揮作用，當(dāng)前世界范圍內(nèi)均以Fhb1為主要抗源開展小麥赤霉病抗性改良工作，抗源相對單一[3]。因此，發(fā)掘新的赤霉病抗源仍然是小麥抗赤霉病研究和育種的迫切任務(wù)。本研究于2017—2021年連續(xù)四年采用單花滴注法，對642份小麥種質(zhì)資源的赤霉病抗擴(kuò)展性（typeⅡ）進(jìn)行了鑒定，以揚麥158（中抗赤霉?。閷φ眨Y選赤霉病抗性種質(zhì)；同時利用Fhb1～Fhb7基因分子標(biāo)記或連鎖分子標(biāo)記對抗性種質(zhì)進(jìn)行檢測，分析抗性種質(zhì)攜帶的抗赤霉病基因，為小麥抗赤霉病研究及抗病育種提供新的抗源及種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在彌霧保濕條件下對642(田間自發(fā)赤霉病抗性表現(xiàn)為中抗或中感以上)份種質(zhì)的赤霉病抗擴(kuò)展性進(jìn)行鑒定，包括育成品種211份、高代品系361份、異染色體系16份、地方品種24份和引進(jìn)品種30份。其中，育成品種分別來自北部冬麥區(qū)(61份)、黃淮冬麥區(qū)(36份)、長江中下游冬麥區(qū)(60份)、西南冬麥區(qū)(54份)；高代品系分別來自北部冬麥區(qū)(93份)、黃淮冬麥區(qū)(33份)、長江中下游冬麥區(qū)(111份)、西南冬麥區(qū)(124份)。以蘇麥3號為抗病對照，揚麥158為中抗對照，安農(nóng)8455為感病對照。其中，揚麥158曾是我國長江中下游麥區(qū)的主栽品種和骨干親本。

1.2 赤霉病抗擴(kuò)展性的鑒定方法

試驗于2017—2018年、2018—2019年、2019—2020年和2020—2021年連續(xù)四年將642份小麥種質(zhì)種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地彌霧保溫大棚內(nèi)，行長0.6 m，行距0.25 m。每隔100份種質(zhì)設(shè)置一組對照，依據(jù)“NY-T 1443.4-2007小麥抗病蟲性評價技術(shù)規(guī)范”，采用單花滴注法，即用連續(xù)注射器于小麥開花期將10 μL混合菌株（F0609、F0301、F0980和F1126）孢子液注入剛開花穗中部的小花中，接種濃度為10倍顯微鏡視野下100個孢子。每份材料接種15～20個穗子。接種后彌霧保濕，21 d后調(diào)查總小穗數(shù)和病小穗數(shù)，按照以下公式計算病小穗率。并以病小穗率與對照相比，評價各參試材料的抗擴(kuò)展性。

病小穗率（%）=（病小穗數(shù)/總小穗數(shù)）×100。

1.3 小麥基因組DNA提取與分子標(biāo)記分析

取連續(xù)3年抗性鑒定為中抗以上（優(yōu)于揚麥158）種質(zhì)的幼嫩葉片置于2.0 mL離心管中，用CTAB法提取小麥基因組DNA。用Fhb1～Fhb7的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，明確不同抗性種質(zhì)攜帶的抗病基因。分子標(biāo)記信息詳見表1。

表1 小麥抗赤霉病基因/QTL連鎖分子標(biāo)記名稱及染色體位置Table 1 Molecular markers of gene/QTL for wheat Fusarium head blight used in the present study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)分析

不同年份間赤霉病病小穗率的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平（表2）。其中，2017—2018年與2019—2020年病小穗率的相關(guān)性最高，為0.41；其次為2018—2019年 與2019—2020年，相 關(guān) 系 數(shù) 為0.31；2020—2021年與其他年份病小穗率的相關(guān)性最低。由此表明，赤霉病抗性在不同年份間相關(guān)系數(shù)較低，需經(jīng)過多年多點鑒定才能對種質(zhì)的赤霉病抗性做出準(zhǔn)確評價。

表2 不同年份642份小麥種質(zhì)赤霉病病小穗率的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficients among environments for percentage of symptomatic spikelets per spike(PSS)of Fusarium head blight of 642 wheat lines

2.2 病小穗率的變異

如表3所示，2017—2018年赤霉病病小穗率變幅最大，平均值也最高（18.41%）；2019—2020年病小穗率變幅最小，平均值也最低（10.53%）。2019—2020年病小穗率變異系數(shù)最高，達(dá)63.90%；2020—2021年病小穗率變異系數(shù)最小，為41.99%。結(jié)果表明不同種質(zhì)之間病小穗率差異數(shù)大，從高抗種質(zhì)到高感種質(zhì)之間病小穗率差異在50%以上即半個麥穗以上。

表3 不同年份642份小麥種質(zhì)的赤霉病病小穗率變異Table 3 Variation in percentage of symptomatic spikelets per spike(PSS)of Fusarium head blight in 642 wheat lines among environments

2.3 抗赤霉病種質(zhì)的篩選

經(jīng)過2017—2021年連續(xù)4年的赤霉病抗擴(kuò)展性鑒定，結(jié)果（表4）表明，3年及以上赤霉病抗性優(yōu)于中抗對照揚麥158的種質(zhì)有81份，包括育成品種33份，高代品系38份，地方品種5份，引進(jìn)種質(zhì)5份，大部分抗性種質(zhì)來自于長江中下游麥區(qū)；連續(xù)4年抗性優(yōu)于揚麥158的種質(zhì)有33份，分別為CD0151268-1、Cp06-57-5-1-2-1F9、Grandin、光明麥1319、浩麥1號、冀師7225-28、劍子麥、克旱10號、南農(nóng)13Y110、寧麥9號、農(nóng)林20、農(nóng)林26、軟稈洋麥、瑞華14405、石優(yōu)17、蘇麥2號、蘇州8921、望水白、武農(nóng)6號、湘1022、新中長、揚11-125、揚11G4、揚12-126、揚12-149、揚12-24、揚麥1、揚麥20、揚麥4號、長江8863、鎮(zhèn)7495、鄭州5（37）和資0821。三年及以上抗性與蘇麥3號相當(dāng)?shù)姆N質(zhì)有9份，分別為望水白、Grandin、浩麥1號、劍子麥、魁小麥、農(nóng)林26、軟稈洋麥、蘇麥2號和武農(nóng)6號（表4；圖1）；連續(xù)4年抗性與蘇麥3號相當(dāng)?shù)姆N質(zhì)有4份，分別為劍子麥、軟稈洋麥、蘇麥2號和Grandin。

圖1 部分小麥種質(zhì)赤霉病抗擴(kuò)展性鑒定Fig.1 Identifications of Fusarium head blight severity of several wheat lines

表4 三年及以上赤霉病病小穗率低于中抗對照揚麥158的種質(zhì)Table 4 Wheat lined showed lower percentage of symptomatic spikelets per spike of Fusarium head blight than Yangmai 158 in at least three years

續(xù)表

2.4 抗赤霉病基因/位點的檢測

為明確赤霉病中抗及以上種質(zhì)所攜帶的抗病基因，利用已知抗赤霉病基因/位點的分子標(biāo)記對這些種質(zhì)進(jìn)行基因型分析，結(jié)果（圖2，表5）表明，對照品種中，蘇麥3號攜帶Fhb1、Fhb2和Fhb5基因；揚麥158不攜帶Fhb1～Fhb7基因；抗性種質(zhì)望水白攜帶Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5基因；蘇麥2號攜帶Fhb1、Fhb4和Fhb5基因；農(nóng)林26攜帶Fhb1和Fhb4基因；劍子麥和軟稈洋麥攜帶Fhb1和Fhb5基因；Grandin攜帶Fhb4基因；新中長攜帶Fhb5基 因；而 浩 麥1號、冀 師7225-28、南 農(nóng)13Y110、石優(yōu)17和武農(nóng)6號未檢測到Fhb1～Fhb7基因，可能攜帶新的抗赤霉病基因。

表5 部分穩(wěn)定中抗及以上（抗擴(kuò)展）種質(zhì)已知抗赤霉病基因型分析Table 5 Genotype of the known gene/QTL for wheat Fusarium head blight in wheat lines

圖2 部分小麥種質(zhì)抗赤霉病基因/位點的基因型Fig.2 Genotypes of gene/QTL known Fusarium head blight in wheat lines

3 討論

小麥赤霉病抗性是受環(huán)境影響較大的數(shù)量性狀，其表型鑒定準(zhǔn)確與否取決于開花期的環(huán)境溫度、濕度及接種方法和赤霉菌孢子液濃度[35]。為準(zhǔn)確評價642份小麥種質(zhì)的赤霉病抗性，本研究連續(xù)4年進(jìn)行鑒定。對4年的抗病性鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，2017—2018年與2019—2020年的病小穗率相關(guān)性最高；其次為2018—2019年與2019—2020年；2020—2021年與其他年份間的鑒定結(jié)果相關(guān)性最低。推測原因可能是2017—2018年小麥開花期氣溫較高，赤霉病發(fā)病條件充分，病害較重；而2019—2020和2020—2021年小麥開花初期（3月底4月初）氣溫較低，異常天氣較多，赤霉病發(fā)病不充分。

近年來，小麥抗赤霉病研究已經(jīng)取得巨大進(jìn)展，F(xiàn)hb1和Fhb7的成功克隆為小麥赤霉病抗性的遺傳解析奠定了基礎(chǔ)。Fhb1貢獻(xiàn)率介于15%～30%[2]，是主效基因，在不同環(huán)境與遺傳背景中穩(wěn)定表現(xiàn)，與其他抗赤霉病基因間存在加性效應(yīng)，因此，將多個效應(yīng)大且穩(wěn)定的抗性基因進(jìn)行聚合、選育高抗赤霉病的小麥新品種是實現(xiàn)小麥抗赤霉病的有效途徑[33-36]。本研究利用Fhb1～Fhb7的分子標(biāo)記對中高抗種質(zhì)進(jìn)行基因型分析發(fā)現(xiàn)，農(nóng)林20、蘇麥3號、蘇麥2號、農(nóng)林26、軟稈洋麥、劍子麥和望水白都含有1～4個抗性基因，因此，具有較好的赤霉病抗性。然而，抗病基因通常與不利的農(nóng)藝性狀連鎖[33]，這些種質(zhì)的農(nóng)藝性狀普遍較差，在育種利用中還需進(jìn)一步改良。

盡管小麥抗赤霉病育種取得了一定的進(jìn)展，但利用抗源相對比較單一，只依賴一個或少數(shù)抗性基因，導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)日益狹窄。因此，挖掘新的赤霉病抗源對小麥抗赤霉病育種具有重要意義。本研究表明，石優(yōu)17、武農(nóng)6號、南農(nóng)13Y110、冀師7225-28、瑞華14405、浩麥1號和揚麥158不攜帶Fhb1～Fhb7基因，推測可能含有新的抗赤霉病基因。Zhang等[36]利用揚麥158和鄭麥9023構(gòu)建作圖群體將赤霉病抗性基因定位于小麥2DS和3AL染色體上。且石優(yōu)17、武農(nóng)6號、南農(nóng)13Y110、冀師7225-28和揚麥158的農(nóng)藝性狀較好，未來在小麥抗赤霉病研究和育種中有極大的利用潛力。

經(jīng)過多年抗赤霉病育種，我國長江中下游麥區(qū)的赤霉病得到有效控制，但是近年來赤霉病逐年南遷北移，黃淮麥區(qū)也開始受到赤霉病威脅。眾所周知，黃淮麥區(qū)是我國小麥最重要的產(chǎn)區(qū)，畝產(chǎn)量在20世紀(jì)90年代初就已經(jīng)達(dá)600 kg以上[37]，但該麥區(qū)缺乏可供育種利用的赤霉病抗源。育種家曾利用長江中下游麥區(qū)的赤霉病抗源改良黃淮麥區(qū)品種，但由于兩個麥區(qū)小麥品種生育期與農(nóng)藝性狀的差異，雜交后代分離嚴(yán)重，難以選育出抗赤霉病、農(nóng)藝性狀又好且適宜黃淮冬麥區(qū)種植的品種[38-41]。本研究在2017—2021年對642份種質(zhì)的赤霉病抗性進(jìn)行鑒定，篩選出5份黃淮麥區(qū)赤霉病抗性達(dá)到中抗以上材料（石優(yōu)17、鄭州5(37)、冀師7225-28、武農(nóng)6號和西農(nóng)9718），有效彌補(bǔ)了黃淮麥區(qū)赤霉病抗性種質(zhì)極度匱乏的現(xiàn)狀。其中，石優(yōu)17和冀師7225-28農(nóng)藝性狀較好，不攜帶Fhb1～Fhb7基因，推測可能含有新的抗赤霉病基因，為黃淮麥區(qū)小麥抗赤霉病育種提供了新的可利用抗性資源。