室內(nèi)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)塵螨、腐食酪螨變應(yīng)原基因的檢測(cè)

薛琪琪，許薇，朱志偉，趙金紅

（皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，安徽 蕪湖241002）

粉螨分布廣泛，普遍孳生于面粉、儲(chǔ)糧、儲(chǔ)藏食品、中藥材以及居室環(huán)境的灰塵中，有些種類可以成為引起人類過(guò)敏性疾病的重要過(guò)敏原，導(dǎo)致螨性皮炎、螨性哮喘，甚至人體內(nèi)螨?。?－2］，對(duì)人類健康產(chǎn)生危害。室內(nèi)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)也是粉螨孳生的重要場(chǎng)所，空調(diào)運(yùn)行時(shí)可將粉螨產(chǎn)生的大量變應(yīng)原通過(guò)空調(diào)風(fēng)吹入室內(nèi)空氣中，被人體吸入后可誘發(fā)哮喘等過(guò)敏性疾病。其中粉塵螨（Dermatophagoides farinae）、屋塵螨（Dermatopha?goides pteronyssinus）和腐食酪螨（Tyrophagus pu?trescentiae）是 粉 螨 中 常 見(jiàn) 的 過(guò) 敏 原 種 類［3］。Voorhorst等［4］在1964年的研究已經(jīng)證明塵螨是屋塵中的主要過(guò)敏原之一。Arroyave等［5］的研究顯示，粉塵螨和屋塵螨是最主要的2種吸入性過(guò)敏原，可導(dǎo)致全身性過(guò)敏性疾病包括過(guò)敏性鼻炎、哮喘、變應(yīng)性球結(jié)膜炎、蕁麻疹、特應(yīng)性濕疹（皮炎）等。近年來(lái)，已有研究對(duì)空調(diào)空氣濾網(wǎng)中屋塵螨、粉塵螨的變應(yīng)原進(jìn)行檢測(cè)，但尚未涉及其他粉螨變應(yīng)原的研究。故本研究分別對(duì)安徽合肥、蕪湖、淮南、淮北4個(gè)地區(qū)的室內(nèi)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)進(jìn)行采集，檢測(cè)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵中是否含有屋塵螨、粉塵螨和腐食酪螨變應(yīng)原，為防治由于粉螨引起的過(guò)敏性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）、克隆載體pMD19－T（大連Takara公司）；土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（SK8233）、Taq PCR Master Mix、DNA聚合酶和DNA marker均購(gòu)于上海生物工程有限公司。

1.2 樣本采集 共采集家用空調(diào)（包括柜式空調(diào)和壁掛式空調(diào)）灰塵144份，分別包括蕪湖、合肥、淮北、淮南32份、36份、41份、35份。采集時(shí)間為夏季7~9月。采集時(shí)取下空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)，用毛刷輕輕將灰塵掃入盤中，再將灰塵樣本分別裝入收集管內(nèi)，記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)和采集人等信息后備用。

1.3 DNA提取、引物設(shè)計(jì)和PCR克隆擴(kuò)增

DNA提取采用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（SK8233）并作稍加改動(dòng)，根據(jù)Genbank公布的粉塵螨1類變應(yīng)原（Der f 1）（AB034946）、屋塵螨1類變應(yīng)原（Der p 1）（U11695）以及腐食酪螨1（Tyr p 1）（DQ983317）設(shè)計(jì)引物序列（表1）。

表1 粉塵螨、屋塵螨、腐食酪螨1類變應(yīng)原基因引物序列

引物交由通用生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為25 μl，含12.5 μl Taq DNA聚合酶、2 μl DNA模板、上下游引物各1 μl、8.5 μl無(wú)菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳和DNA膠回收試劑盒純化后，連接到載體pMD19－T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（DH5α感受態(tài)細(xì)胞）中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性克隆委托通用生物技術(shù)有限公司采用DNA測(cè)序儀（ABI－3730）進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列處理與分析 對(duì)測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接和人工校正，將獲得的核苷酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，以確定是否為目標(biāo)片段。為避免PCR擴(kuò)增可能導(dǎo)致的錯(cuò)配而造成假象的多態(tài)性，本研究中用于數(shù)據(jù)分析的每條序列在同一個(gè)體中至少來(lái)自3個(gè)陽(yáng)性克隆。

2 結(jié)果

2.1 Der f 1、Der p 1和Tyr p 1擴(kuò)增結(jié)果 以提取的空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵DNA為模版，采用特異性引物擴(kuò)增Der f 1、Der p 1、Tyr p 1變應(yīng)原基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，144份灰塵樣本中有30份檢測(cè)出Der f 1變應(yīng)原基因，33份檢測(cè)出Der p 1變應(yīng)原基因，10份樣本檢測(cè)出Tyr p 1變應(yīng)原基因。Der f 1基因擴(kuò)增結(jié)果目的片段長(zhǎng)度為266 bp，Der p 1基因擴(kuò)增結(jié)果目的片段長(zhǎng)度為282 bp，Tyr P 1基因擴(kuò)增結(jié)果目的片段長(zhǎng)度為227 bp（圖1）。

2.2 Der f 1、Der p 1和Tyr p 1基因同源性比對(duì)結(jié)果 本研究檢出安徽地區(qū)的Der f 1的基因序列與已知日本東京地區(qū)檢出的Der f 1基因（Genbank登錄號(hào)AB034946）、泰國(guó)地區(qū)檢出的Der f 1基因（Genbank登錄號(hào)DQ185509）、中國(guó)深圳地區(qū)檢出的Der f 1基因（Genbank登錄號(hào)EF139430）核苷酸序列同源性分別為100%、99.62%、99.62%。

檢出安徽地區(qū)的Der p 1的基因序列與澳大利亞的柏斯和悉尼地區(qū)檢出的Der p 1基因（Gen?bank登錄號(hào)U11695）、美國(guó)北卡羅來(lái)納州檢出的Der p 1基因序列（Genbank登錄號(hào)KJ542093）、中國(guó)鹽城地區(qū)檢出的Der p 1基因（Genbank登錄號(hào)EU148599）核苷酸序列同源性分別為100%、99.64%、98.95%。

檢出安徽地區(qū)的Tyr p 1的基因序列與新加坡地區(qū)檢出的Tyr p 1基因序列（Genbank登錄號(hào)DQ983317）核苷酸同源性為100%。

M：DNA marker；1：粉塵螨1類變應(yīng)原（Der f 1）；2：屋塵螨1類變應(yīng)原（Der p 1）；3：腐食酪螨1類變應(yīng)原（Tyr p 1）圖1 粉塵螨1類變應(yīng)原（Der f 1）、屋塵螨1類變應(yīng)原（Der p 1）、腐食酪螨1類變應(yīng)原（Tyr p 1）擴(kuò)增產(chǎn)物圖

2.3 不同地區(qū)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵Der f 1、Der p 1和Tyr p 1檢測(cè)結(jié)果 在安徽省4個(gè)不同城市中，對(duì)Der f 1、Der p 1和Tyr p 1的基因檢測(cè)結(jié)果也具有一定的差異。Der f 1、Der p 1和Tyr p 1的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果大多集中在合肥和蕪湖2個(gè)城市中，淮北、淮南空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵Der f 1、Der p 1和Tyr p 1檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果較少。144份空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵中，Der f 1基因陽(yáng)檢出率為20.83%（30／144），Der p 1基因陽(yáng)性檢出率為22.92%（33／144），Tyr p 1基因陽(yáng)性檢出率為6.94%（10／144），其中Der f 1和Der p 1基因陽(yáng)性率較高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其中16.67%（24／144）的樣本同時(shí)檢測(cè)出Der f 1和Der p 1 2種變應(yīng)原，只有2.08%（3／144）的樣本同時(shí)檢測(cè)出了Der f 1、Der p 1、Tyr p 1 3種粉螨變應(yīng)原（表2）。

表2 不同地區(qū)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵Der f 1、Der p 1、Tyr p 1檢測(cè)結(jié)果

3 討論

粉螨是引起過(guò)敏性疾病的主要原因之一，而粉塵螨、屋塵螨和腐食酪螨又是居室中常見(jiàn)的螨類。當(dāng)清理衛(wèi)生時(shí)可以將它們拍起懸浮于空中，被空調(diào)吸入并附著于空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中。當(dāng)空調(diào)長(zhǎng)期未清理時(shí)，濾塵網(wǎng)中就會(huì)附著許多灰塵和微生物，其中可能就包括屋塵螨、粉塵螨和腐食酪螨等。當(dāng)再次開(kāi)啟空調(diào)時(shí)，空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中的灰塵就會(huì)隨著空調(diào)風(fēng)排入室內(nèi)空氣內(nèi)，其灰塵中包含的塵螨變應(yīng)原就有機(jī)會(huì)和人體直接或間接接觸，從而導(dǎo)致螨過(guò)敏性疾病如螨性皮炎、哮喘和螨病等［8－9］。湛孝東等［10］采用ELISA法檢測(cè)了從蕪湖市區(qū)不同地區(qū)中采集的空調(diào)隔塵網(wǎng)灰塵的Der f 1、Der p 1的濃度及灰塵提取液的過(guò)敏原性，結(jié)果證實(shí)蕪湖地區(qū)居民空調(diào)隔塵網(wǎng)中含有塵螨過(guò)敏原。練玉銀等［11］分別對(duì)塵螨過(guò)敏的哮喘患者家庭及健康家庭進(jìn)行空調(diào)使用前后空氣中和空調(diào)濾網(wǎng)中灰塵的塵螨主要變應(yīng)原進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)灰塵中存在塵螨抗原，這是室內(nèi)塵螨變應(yīng)原的重要來(lái)源，可以導(dǎo)致過(guò)敏性哮喘。馬忠校等［12］檢測(cè)了開(kāi)啟空氣凈化器前后室內(nèi)空氣中塵螨主要過(guò)敏原的含量變化，發(fā)現(xiàn)使用空氣凈化器可明顯降低室內(nèi)空氣中的塵螨過(guò)敏原的濃度。

空調(diào)濾塵網(wǎng)灰塵中可含有多種引起過(guò)敏性哮喘的螨類。王克霞等［13］采集了安徽省蕪湖市居民空調(diào)隔塵網(wǎng)灰塵樣本，進(jìn)行粉塵螨和屋塵螨1、2、3類變應(yīng)原基因的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)螨性變應(yīng)原基因檢出率為85%，其中以粉塵螨和屋塵螨1、2類變應(yīng)原基因?yàn)橹?。但目前?duì)于空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中是否含有腐食酪螨變應(yīng)原鮮見(jiàn)報(bào)道，故本研究為了進(jìn)一步證實(shí)空調(diào)機(jī)濾網(wǎng)灰塵中存在塵螨變應(yīng)原，以及檢測(cè)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中是否含有腐食酪螨變應(yīng)原，從安徽淮南、淮北、合肥、蕪湖4個(gè)地區(qū)采集共144份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中的粉螨變應(yīng)原基因檢出率最高的是Der p 1（22.92%，33／144），其次為Der f 1（20.83%，30／144）和Tyr p 1（6.94%，10／144）。說(shuō)明空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中沉積的灰塵中含有屋塵螨、粉塵螨和腐食酪螨變應(yīng)原，塵螨變應(yīng)原為空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中的主要變應(yīng)原。并且本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在同一份灰塵樣本中可以同時(shí)檢測(cè)出2種或2種以上塵螨變應(yīng)原，由此可見(jiàn)，當(dāng)空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中同時(shí)含有粉塵螨、屋塵螨變應(yīng)原時(shí)，也含有腐食酪螨變應(yīng)原，三者之間并無(wú)沖突。本研究中塵螨檢出率低于王克霞等［13］的研究（檢出率為85%，17／20），可能與所采集的空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)經(jīng)過(guò)定期清洗次數(shù)，或者采集后樣本保存時(shí)間等有關(guān)。白羽等［14］首次用分子生物學(xué)方法證實(shí)了深圳地區(qū)、北京地區(qū)空調(diào)濾塵網(wǎng)灰塵中檢測(cè)到Der f 1和Der p 1基因，且深圳地區(qū)Der f 1和Der p 1基因檢出率為100%，而北京地區(qū)空調(diào)濾塵網(wǎng)灰塵中同時(shí)Der f 1和Der p 1基因的檢出率僅為40%，指出因深圳地區(qū)常年溫暖潮濕，更適于粉塵螨和屋塵螨的孳生繁殖。本研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于合肥、蕪湖的樣本檢出率高于來(lái)自于淮南、淮北的樣本檢出率，也可能是由于合肥、蕪湖處于安徽中部到南部地區(qū)，相較于安徽北部氣候較為濕潤(rùn)，更適宜塵螨和腐食酪螨的孳生。然而目前關(guān)于合肥、蕪湖、淮南、淮北地區(qū)人群的螨性哮喘發(fā)病率比較尚無(wú)報(bào)道，因此本研究結(jié)果可為上述地區(qū)人群螨性哮喘發(fā)病奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，安徽合肥、蕪湖、淮南、淮北4個(gè)地區(qū)的空調(diào)機(jī)濾塵網(wǎng)中存在塵螨和腐食酪螨變應(yīng)原，應(yīng)重視空調(diào)的清潔與凈化、定期清洗，并且經(jīng)常更換隔塵網(wǎng)，可以減少塵螨和腐食酪螨的孳生，有效地降低居住環(huán)境中變應(yīng)原的含量，通過(guò)減少致敏因素從而降低過(guò)敏性疾病的發(fā)病率。