硝酸鉈對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性

范力海，張欣彤，侯麗萍

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510655）

鉈（Tl）是一種劇毒元素，以一價(jià)和三價(jià)2種形式存在于環(huán)境中。鉈廣泛存在于水環(huán)境中，主要來源于含鉈礦石的加工冶煉及工業(yè)廢水的排放[1]。據(jù)報(bào)道，我國含鉈的鉛鋅礦床主要分布于廣東、甘肅、湖南、云南、陜西等地。有調(diào)查顯示，河南某家礦產(chǎn)冶煉企業(yè)廢水中鉈的濃度可達(dá)361 μg/L[2]。此外，受礦產(chǎn)冶煉影響的農(nóng)田土壤也存在鉈污染的風(fēng)險(xiǎn)。Zhou等[3]對貴州多處受污染村落農(nóng)田土壤中的鉈殘留量進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)土壤中鉈含量最高可達(dá)4.97 mg/kg。而且土壤中的鉈可經(jīng)降雨等途徑進(jìn)入水環(huán)境或通過污染農(nóng)作物直接對人造成危害。因此，環(huán)境中高濃度鉈的存在會(huì)對水生生物生存及人類生活生產(chǎn)造成極大的威脅。

最早，鉈鹽曾用于治療頭蘚等疾病，或者用來制作農(nóng)藥及殺鼠劑，由于意外攝入導(dǎo)致了多起人體中毒事件。近10 a，我國發(fā)生了多起水環(huán)境鉈污染事件，例如2010年廣東北江河段鉈污染事件，2013年廣東賀江河段鉈污染事件，2017 年嘉陵江鉈污染事件等[4]。人體對鉈的吸收速度快、途徑廣，皮膚、呼吸道和胃腸道接觸均可引發(fā)中毒[5]。鉈進(jìn)入生物體后，可通過干擾鉀依賴途徑、取代Na+/K+-ATP酶中的鉀離子、強(qiáng)烈的親硫性（與蛋白質(zhì)或其他生物分子中的巰基具有高親和力）等多種途徑對生物體造成毒害。由此可知，鉈是目前已知的毒理作用較為復(fù)雜且毒性較為嚴(yán)重的劇毒金屬之一[6-7]。

斑馬魚（Danio rerio）是被人們廣泛接受并用于胚胎發(fā)育、遺傳分析、毒理學(xué)和多種人類疾病研究的理想模式生物。運(yùn)用斑馬魚進(jìn)行毒理試驗(yàn)具備操作簡便、成本低、影響因素少并可以監(jiān)測多種毒性指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。筆者以斑馬魚為研究對象，探討硝酸鉈對斑馬魚胚胎發(fā)育的不利影響，測定指標(biāo)包括心率、形態(tài)發(fā)育、超氧化物歧化酶（SOD, superoxide dismutase）和過氧化氫酶（CAT, catalase）活性及幼魚行為，以期為評價(jià)水環(huán)境中鉈對生物體的毒性效應(yīng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 AB品系斑馬魚購自上海費(fèi)曦生物技術(shù)有限公司。AB品系成年斑馬魚于水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中雌雄分開養(yǎng)殖至長期穩(wěn)定，光照周期h光照∶h黑暗=14∶10，每天喂食1～2次豐年蝦脫殼卵。胚胎的獲?。涸囼?yàn)前一晚提前將成年斑馬魚進(jìn)行避光處理，次日上午（10點(diǎn)后）將成魚按雌∶雄=2∶1的比例裝入孵化盒中，產(chǎn)卵后1 h內(nèi)收集魚卵，在解剖鏡下挑選正常受精、形狀飽滿的受精卵用于胚胎毒性試驗(yàn)。

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑有三水硝酸鉈[純度≥97.5%，阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司]，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。試驗(yàn)用水為曝氣自來水，所有暴露液均為每次試驗(yàn)前新配置。主要儀器有體式顯微鏡及成像系統(tǒng)（Leica MC170 HD，新加坡），酶標(biāo)分析儀（Rayto RT-6100，中國），高清攝像頭（RERVISION RERBXH2MP 0550，中國）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 暴露方法 設(shè)置4個(gè)硝酸鉈暴露濃度，分別為5、50、500、1 000 μg/L，并設(shè)置空白對照組（經(jīng)ICD-MS分析，鉈濃度低于0.01 μg/L）。每個(gè)濃度組處理32枚胚胎，并設(shè)置3個(gè)平行組。將正常發(fā)育的胚胎隨機(jī)分裝于24孔板（1枚胚胎/孔），每孔加入1.5 mL溶液，光照周期h光照∶h黑暗=14∶10，溫度27℃，暴露總時(shí)間為168 h，每24 h更換一次溶液，及時(shí)吸出死亡的胚胎或幼魚。

1.2.2 斑馬魚胚胎形態(tài)觀察及心率記錄 進(jìn)行硝酸鉈暴露處理后，使用體視顯微鏡觀察斑馬魚胚胎在發(fā)育過程中的形態(tài)變化，并使用顯微鏡攝像系統(tǒng)獲取胚胎形態(tài)照片與心博視頻用于形態(tài)觀察與心率計(jì)數(shù)。

1.2.3 胚胎酶活性檢測 將胚胎置于離心管中，每處理選取8枚胚胎，去除殘余液體，稱量后加入一定量的PBS（pH值7.4），用勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。3 000 r/min離心20 min，收集上清，按試劑盒說明書方法測定SOD及CAT酶活性。

1.2.4 幼魚行為記錄 每次試驗(yàn)開始時(shí)隨機(jī)挑選1條暴露168 h的斑馬魚幼魚放入透明塑料立方盒（2.9 cm×2.9 cm×1.9 cm，盛有16 mL的對應(yīng)暴露試驗(yàn)溶液）中。立方盒放置在RERVISION高清攝像頭鏡頭下，并調(diào)試設(shè)備與軟件設(shè)定（Noldus EthoVision XT 11.5）。用發(fā)光板進(jìn)行白光照射，并阻擋日光。行為測試在同一時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行，且所有試驗(yàn)在3 h內(nèi)完成。斑馬魚的行為由攝像裝置以每秒60幀（fps）、1 280×720像素分辨率進(jìn)行監(jiān)測記錄。每條斑馬魚放入盒中后，適應(yīng)1 min后錄制5 min的行為活動(dòng)。斑馬魚幼魚皆可在盒中自由游動(dòng)，其游動(dòng)軌跡被攝像機(jī)記錄并傳入計(jì)算機(jī)，由 Noldus EthoVision XT 11.5軟件記錄并分析。區(qū)域的劃分參考EthoVision XT 操作參考手冊（EthoVision XT Reference Manual）：在垂直組中，將立方盒側(cè)剖面正方體區(qū)域作為斑馬魚整體活動(dòng)范圍，并在軟件中將該區(qū)域按三等分劃分為上層、過渡層、底層3個(gè)區(qū)域；在平面組中，將立方盒俯視面正方體作為斑馬魚整體活動(dòng)范圍，并在軟件中按2∶1將該區(qū)域分為中心區(qū)與邊緣區(qū)。對照組、5 μg/L及50 μg/L TlNO3試驗(yàn)組，各組隨機(jī)挑取斑馬魚幼魚10條，記錄每條斑馬魚5 min內(nèi)的移動(dòng)距離、平均速度與在各區(qū)域內(nèi)的停留時(shí)間[10-11]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用IBM SPSS Statistics 26統(tǒng)計(jì)分析軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA）、差異顯著性分析及t檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鉈對斑馬魚心率的影響

由于暴露168 h時(shí)1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚數(shù)不足以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，故選取暴露48、96與156 h時(shí)各處理組斑馬魚幼魚心率進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。處理48 h后，各組斑馬魚胚胎心率相近，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。處理96 h后，50、500及1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚心率與對照組相比顯著降低。處理156 h后，50、500和1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚心率與對照組相比顯著降低，且下降幅度隨著硝酸鉈濃度的增加而增大。此外，500、1 000 μg/L TlNO3處理組暴露156 h后斑馬魚幼魚的心率顯著低于暴露96 h時(shí)的。

圖1 不同暴露時(shí)間各處理組斑馬魚的胚胎心率

2.2 硝酸鉈對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸型毒性

斑馬魚胚胎于受精后72 h進(jìn)入孵化期，在此之前各試驗(yàn)組胚胎形態(tài)無明顯區(qū)別（圖2）；暴露84 h時(shí)500和1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚出現(xiàn)孵化延遲或發(fā)育阻滯的現(xiàn)象，幼魚卵黃囊仍膨大，魚鰾發(fā)育慢于對照組；暴露144 h時(shí)50、500及1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚出現(xiàn)魚鰾發(fā)育不完全、心囊水腫與脊柱彎曲的現(xiàn)象；暴露168 h時(shí)500及1 000 μg/L TlNO3處理組幼魚脊柱彎曲、心囊水腫現(xiàn)象變的更為明顯。

圖2 同暴露時(shí)間各處理組斑馬魚形態(tài)發(fā)育的比較

2.3 硝酸鉈對斑馬魚SOD酶活的影響

由圖3可知，與對照組對比，暴露24 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的SOD活性顯著降低；暴露72 h后，1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的SOD活性極顯著降低；暴露96 h后，5、50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的SOD活力分別降低6.7%、12.7%、33.7%、26.7%，其中500、1 000 μg/L TlNO3處理組與對照組差異極顯著。

圖3 不同暴露時(shí)間各處理組斑馬魚胚胎的SOD活性

2.4 硝酸鉈對斑馬魚CAT酶活的影響

由圖4可知，與對照組對比，暴露24 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的CAT活性顯著降低；暴露72 h后，50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的CAT活性極顯著降低；暴露96 h后，5、50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚胚胎的CAT活力分別降低13.6%、34.4%、37.3%、57.0%，其中50、500、1 000 μg/L TlNO3處理組與對照組差異顯著。

圖4 不同暴露時(shí)間各處理組斑馬魚胚胎的CAT活性

2.5 硝酸鉈暴露對幼魚行為的影響

此次試驗(yàn)用斑馬魚從受精后即開始進(jìn)行各濃度TlNO3溶液暴露處理。暴露持續(xù)168 h后，500和1 000 μg/L TlNO3處理組斑馬魚幾乎全部死亡，對照組與5、50 μg/L TlNO3處理組剩余斑馬魚幼魚孵化后能夠自主活動(dòng)。

由圖5A和D可知，對照組幼魚在進(jìn)入新魚缸后，部分幼魚長時(shí)間在容器壁邊小幅度移動(dòng)，大部分幼魚能夠在一段時(shí)間內(nèi)自主開始探索四周，并在各區(qū)域保持較活躍的游動(dòng)。

與對照組相比，5 μg/L TlNO3處理組幼魚進(jìn)入新魚缸后比較活躍，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)軌跡增多、運(yùn)動(dòng)軌跡紊亂（圖5B）、游動(dòng)距離大（圖6）、平均速度快（圖7）等。該組幼魚在平面的游動(dòng)總距離與平均速度遠(yuǎn)大于對照組與50 μg/L試驗(yàn)組的幼魚。在水平面上，停留在中心區(qū)域的時(shí)間占比更多（圖5B，圖8）；在垂直面上，該組幼魚更傾向在水底游動(dòng)，且在游動(dòng)時(shí)難以控制在水中漂浮的深度，具體表現(xiàn)在垂直面上反復(fù)下沉上?。▓D5E、圖9）。

圖5 各處理組斑馬魚幼魚平面及垂直運(yùn)動(dòng)的軌跡

圖6 0～50 μg/L TlNO3處理組斑馬魚幼魚平面游動(dòng)的距離

圖7 0～50 μg/L TlNO3處理組斑馬魚幼魚平面游動(dòng)的速度

圖8 0～50 μg/LTlNO3處理組斑馬魚幼魚在平面各區(qū)域停留的時(shí)間

與對照組相比，50 μg/L TlNO3處理組幼魚轉(zhuǎn)入新魚缸后出現(xiàn)長時(shí)間呆滯不動(dòng)（圖5C）、游動(dòng)時(shí)震顫和小范圍內(nèi)多次擺動(dòng)頭部等現(xiàn)象。在垂直面上，該組幼魚更傾向于長時(shí)間在水面呆滯（圖5F、圖9），且游動(dòng)時(shí)難以下沉，這與形態(tài)觀察中暴露組幼魚的魚鰾發(fā)育不良的結(jié)果相吻合。

圖9 0～50 μg/LTlNO3處理組斑馬魚幼魚在垂直各區(qū)域停留的時(shí)間

以上結(jié)果表明，胚胎期和幼魚早期階段持續(xù)性硝酸鉈暴露能夠改變幼魚的行為方式。幼魚的行為強(qiáng)度變化與環(huán)境中鉈濃度之間存在倒“U”型的關(guān)系，即在168 h內(nèi)，5 μg/L硝酸鉈暴露具有運(yùn)動(dòng)興奮效應(yīng)，而50 μg/L硝酸鉈暴露則表現(xiàn)出抑制幼魚活動(dòng)的作用。從胚胎時(shí)期開始長時(shí)間硝酸鉈暴露能夠影響斑馬魚胚胎的器官發(fā)育，從而損害幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力。

3 討 論

心率是衡量心臟活動(dòng)與功能的重要指標(biāo)之一。受精24 h后，斑馬魚心血管即將形成、心臟即將開始收縮[12]，受精48 h后即可在解剖鏡下清晰觀察到來自右側(cè)心室和左側(cè)心房的心臟環(huán)路，且隨著胚胎的不斷發(fā)育，斑馬魚成魚的心率能夠達(dá)到140～180次/min。因此，受精后48 h即可觀察斑馬魚胚胎的心跳頻率[13]。斑馬魚心臟易受毒物影響[14]，心跳的快慢在一定程度上也可以反映斑馬魚心臟在毒物脅迫下的發(fā)育情況與組織器官狀況，用于判斷硝酸鉈對斑馬魚生理發(fā)育的影響。

該試驗(yàn)通過對斑馬魚心率的測定，發(fā)現(xiàn)暴露48 h時(shí)，各處理組斑馬魚胚胎心率差異不大；暴露96 h后，隨著斑馬魚幼魚的發(fā)育與孵出，各處理組的斑馬魚幼魚心率有所加快，但與對照相比，較高濃度的硝酸鉈處理使斑馬魚幼魚心率顯著下降；暴露156 h后，斑馬魚幼魚的心率與硝酸鉈處理濃度成反比，即硝酸鉈處理濃度越高，斑馬魚幼魚心率越慢，且500、1 000 μg/L TlNO3處理組暴露156 h后斑馬魚幼魚的心率顯著低于暴露96 h時(shí)的。

觀察發(fā)現(xiàn)，硝酸鉈對斑馬魚的致畸型毒性表現(xiàn)為幼魚發(fā)育阻滯、魚鰾發(fā)育遲緩或發(fā)育不完全、脊柱彎曲及心囊水腫等。斑馬魚胚胎發(fā)生心囊水腫的原因可能有2種，一是水屏障被破壞，一是體內(nèi)的排水功能異常。魚類腎臟可以維持機(jī)體水和電解質(zhì)的平衡，而腎臟功能的紊亂則可能導(dǎo)致血液高滲效應(yīng)，使細(xì)胞外的液體排出血管，從而導(dǎo)致水腫的發(fā)生[15]。同時(shí)，鉈離子可以進(jìn)入胚胎內(nèi)部，通過損害Na+/K+-ATP酶、干擾蛋白質(zhì)的合成、擾亂細(xì)胞膜內(nèi)外的離子梯度，造成心囊水腫、脊柱彎曲等組織病變。Long等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ABCC5在斑馬魚胚胎發(fā)育和解除重金屬毒性過程中發(fā)揮了重要作用。顯性失活的ABCC5會(huì)引起斑馬魚胚胎發(fā)育阻滯，而重金屬則可以導(dǎo)致斑馬魚胚胎ABCC5表達(dá)上調(diào)[17]。

試驗(yàn)結(jié)果還表明，硝酸鉈處理顯著降低了斑馬魚胚胎的SOD和CAT酶活性，破壞了斑馬魚胚胎的抗氧化能力；同時(shí)還表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系[18]，即硝酸鉈濃度越高，SOD及CAT酶活性降低程度越大。SOD是活性氧清除劑，可以將生物經(jīng)氧化產(chǎn)生的活性氧（ROS）自由基歧化為H2O2和O2，避免ROS對機(jī)體的毒害[19]。在低濃度或短時(shí)間內(nèi)，胚胎內(nèi)SOD活性因重金屬脅迫而升高，而在高濃度或長時(shí)間的重金屬脅迫下，胚胎內(nèi)SOD活性則被抑制[20]。這些現(xiàn)象表明，硝酸鉈處理導(dǎo)致受試斑馬魚胚胎體內(nèi)·O2-增多，超出了SOD的清除能力，抑制了SOD活性。CAT是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，可催化H2O2分解為O2和H2O，防止H2O2對機(jī)體的毒害[19]。該研究中硝酸鉈處理對CAT活性同樣表現(xiàn)為低濃度或短時(shí)間誘導(dǎo)-抑制、高濃度或長時(shí)間抑制。以上現(xiàn)象均表明，在硝酸鉈處理下，斑馬魚機(jī)體清除含氧自由基的機(jī)制已嚴(yán)重失衡，因此機(jī)體內(nèi)過多的活性氧可能通過誘導(dǎo)ABCC5表達(dá)，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯。

斑馬魚是晝行性動(dòng)物，在光照下活動(dòng)，在黑暗中多表現(xiàn)為靜止?fàn)顟B(tài)[21]。該試驗(yàn)觀察了暴露處理168 h后的斑馬魚幼魚在新魚缸中的自發(fā)活動(dòng)與行為。此時(shí)幼魚的肌節(jié)和心臟、腦、魚鰾等器官基本形成[22]。與病理損傷、生理生化數(shù)據(jù)相比，斑馬魚自發(fā)行為活動(dòng)更能直觀地反映其整體功能發(fā)育。斑馬魚通常在靠近水面位置保持較活躍的游動(dòng)，但在進(jìn)入新魚缸后，通常會(huì)長時(shí)間待在容器底部、容器邊緣保持靜止不動(dòng)，減少探索行為和停留在容器壁附近、水面附近的時(shí)間[10]，這表明斑馬魚處在一種高度焦慮的狀態(tài)下[23]。一段時(shí)間后，斑馬魚才會(huì)在新魚缸中開始四處探索[24]，增加魚缸中心區(qū)域停留、運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

在較低濃度的硝酸鉈溶液暴露下，斑馬魚表現(xiàn)出較興奮狀態(tài)，游動(dòng)距離長，游動(dòng)平均速度快，推測低濃度的硝酸鉈暴露能影響斑馬魚胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，改變其興奮抑制功能；而高濃度的硝酸鉈嚴(yán)重?fù)p害了斑馬魚的組織器官功能，從而使斑馬魚表現(xiàn)為長時(shí)間的呆滯與行動(dòng)遲緩。斑馬魚幼魚的行為強(qiáng)度變化與環(huán)境中硝酸鉈濃度之間存在倒“U”型劑量效應(yīng)關(guān)系，在5 μg/L硝酸鉈脅迫時(shí)斑馬魚幼魚活動(dòng)增多、紊亂，游動(dòng)距離與平均速度增大；50 μg/L硝酸鉈暴露使斑馬魚行為出現(xiàn)遲緩、呆滯、活動(dòng)減少與長時(shí)間停留水面現(xiàn)象。故硝酸鉈暴露能夠影響斑馬魚幼魚的自發(fā)活動(dòng)行為。較低濃度硝酸鉈暴露能使斑馬魚幼魚表現(xiàn)興奮狀態(tài)；較高濃度硝酸鉈暴露能使斑馬魚幼魚表現(xiàn)出遲緩呆滯狀態(tài)。且硝酸鉈處理組幼魚出現(xiàn)了難以控制在水中位置、下沉困難等現(xiàn)象，這與斑馬魚形態(tài)觀察結(jié)果中幼魚魚鰾發(fā)育不良的結(jié)果相吻合。