內(nèi)生菌株4-3培養(yǎng)條件的優(yōu)化

龔 平，陳 嫻，李詠梅，曾 艷，唐冰璇，蔣海燕，劉冬華，伍善東

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

植物內(nèi)生菌（Plant endophyte）是指能夠定殖在植物組織內(nèi)部，對宿主植物不造成任何感染或負(fù)面影響的一類微生物。植物內(nèi)生菌對宿主植物的已知有益作用有固氮作用、促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)抗逆性、抗病原真菌及細(xì)菌能力等?；谥参飪?nèi)生菌這些有益作用，其可作為優(yōu)良的潛在生防資源和外源基因載體。近年來，隨著人類環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，綠色農(nóng)業(yè)的興起，內(nèi)生菌已逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點[1-7]。湖南省微生物研究院前期在對從油菜植株中分離得到的內(nèi)生菌進(jìn)行功能篩選時，發(fā)現(xiàn)一株優(yōu)秀內(nèi)生菌株4-3，該菌株不僅具有很強(qiáng)的拮抗菌核病核盤病菌的能力，還具有優(yōu)良的溶磷解鉀的功能，具有良好的應(yīng)用前景。試驗對內(nèi)生菌4-3的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為該菌株的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生菌株4-3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），油菜內(nèi)生菌，由課題組分離、篩選，該菌株具有很強(qiáng)的拮抗菌核病核盤病菌的能力，還具有優(yōu)良的溶磷解鉀的功能。保藏編號為CCTCC M NO:2014320。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA加富培養(yǎng)基：20%土豆（煮汁），2.0%葡萄糖，0.2%酵母膏，0.05%硫酸鎂，0.1%磷酸二氫鉀，1.8%瓊脂，pH值7.0，用于菌株4-3斜面培養(yǎng)與活化；PDA液體培養(yǎng)基：20%土豆（煮汁），2.0%蔗糖，0.2%酵母膏，0.1%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，pH值7.0，用于菌株4-3液體培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 活菌計數(shù)方法 吸取試驗菌液5 mL至裝有玻璃珠、45 mL無菌水的錐瓶中，180 r/min震蕩30 min，吸取震蕩好的菌液0.5 mL至4.5 mL無菌蒸餾水中進(jìn)行稀釋至8階(含三角瓶稀釋的一階)。每次吸取前均將稀釋菌液在振蕩器上振蕩1分鐘，隨后倒序吸取0.5 mL稀釋菌液于滅過菌的平皿中；平行3皿。然后倒入已經(jīng)融化好的滅菌的PDA固體培養(yǎng)基(約40～45℃)20 mL左右。充分搖勻，待其完全冷卻后倒置；30℃恒溫培養(yǎng)48 h進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 按 2% 的接種量將菌株4-3種子液轉(zhuǎn)接至 100 mL PDA液體培養(yǎng)基，分別置于20、24、28、32、36℃搖床上發(fā)酵培養(yǎng)48 h，按1.2.1方法測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳培養(yǎng)溫度。每個處理3個重復(fù)。

1.2.3 最佳初始pH值的優(yōu)化 調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH為 6.0、6.4、7.0、7.2、7.6、8.0，其他條件同1.2.2，在最佳培養(yǎng)溫度條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，確定最佳初始pH值。每個處理3個重復(fù)。1.2.4 最佳接種量的確定 在最佳培養(yǎng)溫度和初始pH 值條件下，分別按 1%、2%、3%、4%、5% 接種，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，確定最佳接種量。每個處理3個重復(fù)。

1.2.5 液體培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速的確定 在最佳培養(yǎng)溫度和初始 pH 值條件下，以3%的初始接種量接種菌株4-3，放到不同轉(zhuǎn)速的搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別調(diào)為 160、180、200、220、240 r/min；其余條件不變。按前述的實驗方法進(jìn)行活菌計數(shù)。每個處理3個重復(fù)。

1.2.6 培養(yǎng)時間的優(yōu)化 在最佳培養(yǎng)溫度和初始 pH值條件下，以3%的初始接種量接種菌株4-3，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速220 r/min ；其余條件不變。發(fā)酵時間分別調(diào)為40、44、48、52、56、60和 64 h，按前述的實驗方法進(jìn)行活菌計數(shù)。每個處理3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳培養(yǎng)溫度的確定

分別在 20～36℃溫度條件下對菌株 4-3培養(yǎng) 48 h，如圖1所示，不同培養(yǎng)溫度對菌株4-3 的活菌量有較大影響，該菌株在20～36℃均可生長，但低于24℃時長勢不佳，但在28～36℃條件下活菌數(shù)均超過 108CFU/mL，其中當(dāng)溫度為 32℃時達(dá)到1.99×108CFU/mL，活菌數(shù)最高。故可認(rèn)為菌株4-3 的最佳培養(yǎng)溫度為 32℃。

圖1 培養(yǎng)溫度對菌株4-3生長的影響

2.2 最佳初始pH值的確定

分別在初始pH值為6.0、6.4、7.0、7.2、7.6、8.0的條件下對菌株4-3進(jìn)行培養(yǎng)，如圖2所示，菌株4-3在pH值6.4～8.0范圍內(nèi)生長較好，說明該菌株有一定的耐酸、堿能力。其中在 pH值7.0～7.2 時菌體生長量較高，因此，將初始 pH 值設(shè)定為7.2，此條件下菌株4-3活菌數(shù)最高，達(dá)到1.65×108CFU/mL。

圖2 初始pH值對菌株4-3生長的影響

2.3 初始接種量的確定

如圖3所示，當(dāng)接種量為1%～5% 時，菌株4-3活 菌 數(shù) 分 別 為 1.22×108、1.71×108、2.12×108、2.29×108、2.18×108CFU/mL。隨著接種量的增加，菌株4-3的活菌數(shù)呈上升趨勢；但當(dāng)接種量超過3%時，活菌數(shù)增加不明顯，并且接種量過大，或?qū)е屡囵B(yǎng)基營養(yǎng)成分的過度消耗所引起活菌數(shù)下降，因此選擇 3% 作為菌株4-3的最佳接種量。

圖3 接種量對菌株4-3生長的影響

2.4 最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的確定

當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為 160～220 r/min 時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌體生長量逐漸增加，并且在220 r/min時達(dá)到最大值。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過220 r/min 時，菌體生長量明顯下降，說明轉(zhuǎn)速太高不利于菌株生長，可能是由于高轉(zhuǎn)速導(dǎo)致菌體細(xì)胞機(jī)械損傷而影響其生長，或引起菌體自溶，從而導(dǎo)致活菌數(shù)降低。因此，選擇 220 r/min作為液體培養(yǎng)菌株4-3的最適轉(zhuǎn)速（圖 4）。

圖4 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對菌株4-3生長的影響

2.5 最適培養(yǎng)時間的確定

從圖5可以看出，菌株4-3在培養(yǎng)40～64 h 時，菌體生長量整體維持在一個穩(wěn)定并且較高的水平；在40～56 h，隨著時間的增加，4-3菌體活菌數(shù)呈現(xiàn)增長的趨勢，并在 56 h 時到達(dá)最大值；在 56～64 h，隨著時間的延長，菌體生長量呈下降趨勢，可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝物的產(chǎn)生導(dǎo)致菌體生長速度變緩，綜合以上結(jié)果，確定 56 h 為 4-3 菌株最佳培養(yǎng)時間。

圖5 培養(yǎng)時間對菌株4-3生長的影響

3 結(jié)論與討論

對一株優(yōu)秀內(nèi)生菌株4-3的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度 32℃，初始pH值7.2，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速220 r/min，接種量3% ，培養(yǎng)56 h，該條件下可獲得較高濃度的菌體。

內(nèi)生菌株4-3具有很強(qiáng)的拮抗菌核病核盤病菌的能力。核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一種廣譜性病原真菌，由其引起的菌核病是油菜的主要病害之一。在中國，菌核病可引起油菜減產(chǎn)10%～80%[7-8]；目前，在生產(chǎn)上以選擇抗病品種和化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但存在抗病品種資源缺乏，以及化學(xué)藥劑污染農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境等問題，而生物防治具有對環(huán)境污染小、成本低、作用持久等優(yōu)點，越來越受到人們的重視，因而內(nèi)生菌4-3具有潛在的巨大應(yīng)用價值。此外，內(nèi)生細(xì)菌4-3還具有優(yōu)良的溶磷解鉀的功能，制成生物菌肥，能減少化肥的使用量，因此內(nèi)生菌4-3在發(fā)展我國綠色農(nóng)業(yè)方面具有巨大的應(yīng)用前景。要將內(nèi)生菌4-3制成生物產(chǎn)品，進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，就必須確定其最佳發(fā)酵條件。研究對該菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，將為其應(yīng)用推廣提供有效數(shù)據(jù)，能有效降低未來生產(chǎn)成本。不過，內(nèi)生菌4-3與宿主植物體聯(lián)合代謝產(chǎn)生更優(yōu)生理特性的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。