黃芪中黃酮類化合物的超臨界流體色譜分離方法研究

趙淑軍，董姣姣，劉 潔，賈志鑫，閆曉寧，郁映婷，陳奕君，李月婷，肖紅斌*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹和斂瘡生肌等功效［1］。研究表明，黃芪主要含黃酮、皂苷及多糖三大類化合物，其中黃酮類化合物主要包括異黃酮類、異黃烷類、紫檀烷類等［2］。黃酮類化合物具有良好的藥理活性，以及抗氧化、抗心肌缺血、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)細(xì)胞免疫等作用［3－4］。2010版《中國(guó)藥典》已將黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷列為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［5］。目前，分離測(cè)定黃芪中黃酮類成分的方法主要有薄層色譜法（TLC）［6］、高效液相色譜法（HPLC）［7－8］、高效液相色譜－高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法（HPLC－ESI－TOF MS）［9］等。TLC法具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，但作為定量方法，具有損失樣品和誤差較大等缺點(diǎn)。張妍等［10］利用HPLC同時(shí)測(cè)定黃芪中10種黃酮類成分，用時(shí)54min，耗時(shí)較長(zhǎng)；陳婷等［9］采用HPLC－ESITOF MS法測(cè)定黃芪中黃酮類成分，方法靈敏度高，能夠同時(shí)定量分析24種黃酮類成分，時(shí)長(zhǎng)為25min，但所需設(shè)備昂貴，不具有普遍性。

超臨界流體色譜（SFC）被認(rèn)為是一種能夠與傳統(tǒng)液相色譜法互為補(bǔ)充的快速分離技術(shù)，已收錄在2015版《中國(guó)藥典》新增通則中［11］。SFC的快速分析技術(shù)不僅適用于手性化合物的分析，在復(fù)雜成分中藥中的應(yīng)用也逐漸增加。Pfeifer等［12］采用SFC法在6min內(nèi)成功分離8種香豆素類化合物，并測(cè)定了白芷中3種香豆素化合物的含量，而傳統(tǒng)分析方法至少需要20min。Murauer等［13］采用SFC法在金雞納樹(shù)中分析了7種結(jié)構(gòu)極為相似的生物堿類化合物。Zhu等［14］建立的SFC法成功分離了20個(gè)螺甾皂苷，并總結(jié)了SFC分離甾體皂苷的色譜行為規(guī)律及特點(diǎn)，證明了SFC對(duì)區(qū)別皂苷中不同位置的取代基具有優(yōu)勢(shì)。Huang等［15］建立的SFC法在18min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了12種黃酮類化合物的基線分離，并在滁菊、貢菊、杭菊、亳菊中測(cè)定了5種黃酮類化合物的含量。

針對(duì)黃芪中黃酮類化學(xué)成分的快速分離與分析，本文以黃芪中9種黃酮類化合物（毛蕊異黃酮、芒柄花素、山奈酚、槲皮素、異鼠李素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、紫云英苷、異槲皮苷、芒柄花苷）為目標(biāo)物，考察影響SFC法分離的各種因素，建立了快速分析方法，并與HPLC法進(jìn)行比較。最終建立了測(cè)定黃芪飲片中5種主要黃酮類化合物含量的SFC方法，進(jìn)而對(duì)黃芪飲片樣品進(jìn)行測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent1260超臨界流體色譜儀、Agilent ZORBAX RX－SIL色譜柱（4.6 mm×150mm，5μm）購(gòu)于美國(guó)安捷倫公司；Waters ACQUITY UPC2TMBEH2－EP色譜柱（3mm×100mm，1.7 μm）購(gòu)于沃特世科技（上海）有限公司；SHISEIDO CAPCELL PAK C18柱（4.6 mm×150mm，5μm）購(gòu)于資生堂中國(guó)投資有限公司；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司；智能恒溫水浴鍋購(gòu)于北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；NewClassic MF分析天平購(gòu)于瑞士梅特勒公司。

二氧化碳（純度≥99.99 %）購(gòu)自北京北氧利來(lái)公司；甲醇、異丙醇、乙腈、乙醇、甲酸、乙酸、磷酸均為色譜純，購(gòu)自Thermo Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水來(lái)自Milli-Q水純化系統(tǒng)（電阻率為18.2 MΩ·cm）。對(duì)照品：毛蕊異黃酮（M－021－170926）、芒柄花素（C－018－171217）、山奈酚（S－014－160708）、槲皮素（H－009－180615）、異鼠李素（Y－039－160601）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（M－020－170926）、紫云英苷（Z－020－181205）、異槲皮苷（Y－076－161216）、芒柄花苷（M－013－170926），純度均＞98.5 %，購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

黃芪藥材購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司，留存于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研樓中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備 取黃芪藥材粉末（過(guò)5號(hào)篩）約2.00 g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，加入30mL甲醇，超聲處理30min，重復(fù)提取2次，合并提取液，于45℃下蒸發(fā)儀濃縮至近干，所得浸膏用甲醇溶解，定容至5mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，備用。

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取毛蕊異黃酮、芒柄花素、山奈酚、槲皮素、異鼠李素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、紫云英苷、異槲皮苷、芒柄花苷適量，配成質(zhì)量濃度分別為4.56 、4.01 、5.25 、6.74 、5.38 、6.08 、5.26 、5.84 、5.43 mg/mL的對(duì)照品溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 色譜條件 SFC條件為：Agilent ZORBAX RX－SIL色譜柱（4.6 mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為CO2（A）－0.1%磷酸甲醇溶液（B），梯度洗脫：0～4min，10%B；4～15min，10%～25%B。背壓：10MPa，柱溫：35℃，流速：3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm，進(jìn)樣體積：5μL。

HPLC條件為：SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為水（A）－乙腈（B），梯度洗脫：0～10min，10%～20% B；10～15min，20%～25% B；15～25min，25%～28%B；25～40min，28%～30% B；40～60min，30%～40% B。柱溫：30℃，流速：1mL/min，進(jìn)樣量：10μL，進(jìn)樣預(yù)平衡：20min。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFC分離條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱 固定其他色譜條件，考察Agilent ZORBAX RX－SIL（4.6 mm×150mm，5μm）和Waters ACQUITY UPC2TMBEH2－EP（3mm×100mm，1.7 μm）兩種色譜柱對(duì)9種黃酮類化合物的分離效果，兩柱的流速分別設(shè)為3、1.3 mL/min，分離結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明：BEH2－EP色譜柱對(duì)黃酮類化合物的保留更強(qiáng)，導(dǎo)致化合物在特定條件下未能洗脫?？赡苁怯捎赟FC的流動(dòng)相中不含水，在SFC中微弱的分子間作用力（如偶極－偶極作用、電荷轉(zhuǎn)移作用）對(duì)化合物和固定相間的保留具有較大影響［16］。因此，吡啶基團(tuán)中氮原子的氫鍵作用和吡啶基團(tuán)與黃酮類化合物產(chǎn)生的π－π共軛作用對(duì)化合物保留產(chǎn)生了很大的影響。而9種化合物在RX－SIL色譜柱上達(dá)到了基線分離，并有滿意的峰形和分離度。以logP為參數(shù)解釋黃酮類化合物的保留順序與色譜柱之間的關(guān)系，表1為9個(gè)黃酮類化合物和兩種色譜柱的logP值。由圖1可見(jiàn)，洗脫順序以化合物結(jié)構(gòu)差異分為兩類：黃酮類（異鼠李素、山奈酚、槲皮素、紫云英苷、異槲皮苷）和異黃酮類（芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷），色譜保留均隨logP值的減小而增大，其原因可能是由于黃酮類化合物中含有羥基數(shù)目多，極性較大，需要較大極性的色譜柱對(duì)其進(jìn)行保留；同時(shí)色譜柱的logP值要小于分析物的logP值，才能達(dá)到一定的分離度。因此，選擇Agilent ZORBAX RX－SIL色譜柱用于SFC分析。

表1 9種黃酮類化合物及色譜柱的logP值Table1 logP of nine flavonoids and two cloumns

圖1 9種黃酮類化合物在兩種色譜柱上的分離色譜圖Fig.1 SFC chromatograms of nine flavonoids on different columns

2.1.2 改性劑由于CO2極性較弱，需加入改性劑增加超臨界CO2流體的極性，從而增加流動(dòng)相的洗脫和溶解能力。保持其它條件不變，考察了4種不同極性的常用改性劑（甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇）對(duì)黃芪中9種黃酮類化合物的保留行為，其中乙腈是不具有氫鍵供體性質(zhì)的有機(jī)溶劑，其他醇類為具有氫鍵供體性質(zhì)的有機(jī)溶劑［17－18］。結(jié)果表明，4種改性劑對(duì)化合物的洗脫能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭状迹疽掖迹井惐迹疽译妫?dāng)改性劑極性增大時(shí)（即流動(dòng)相極性增大時(shí)），黃酮類化合物的溶劑化能力增強(qiáng)，分離效果越好。乙腈對(duì)化合物的保留最強(qiáng)，乙醇和異丙醇則會(huì)導(dǎo)致不同程度的化合物共洗脫現(xiàn)象。因此，選擇甲醇為最佳改性劑。

2.1.3 添加劑由于黃酮類化合物一般含有較多羥基，易與硅膠色譜柱中的硅醇基形成氫鍵，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的色譜峰出現(xiàn)拖尾。為改善這一現(xiàn)象，需在改性劑中加入添加劑（酸、堿或鹽）。考察了改性劑中分別添加0.1 %的甲酸、乙酸和磷酸時(shí)對(duì)9種黃酮類化合物峰拖尾現(xiàn)象的改善程度。結(jié)果顯示，當(dāng)添加劑為0.1%磷酸時(shí)，9種黃酮類化合物的拖尾因子和峰寬值最小，改善效果最佳。當(dāng)添加劑為0.1 %甲酸和0.1 %乙酸時(shí)，二者雖能競(jìng)爭(zhēng)抑制黃酮酚羥基與硅醇基形成氫鍵，對(duì)拖尾有一定的改善作用，但由于添加劑在流動(dòng)相中所占比例很小，因此需加入酸性較強(qiáng)的磷酸來(lái)抑制黃酮酚羥基與硅醇基形成氫鍵。

2.1.4 流速超臨界流體的粘度較低，其壓力較低，因此可改變的流速范圍較廣。保持其他色譜條件一致，考察了不同流速下9種黃酮類化合物的色譜保留行為（圖2）。結(jié)果表明，隨著流速的增加，各化合物色譜峰的保留逐漸減?。▓D2A），且峰形逐漸尖銳（圖2B），但由于出峰時(shí)間快而降低了部分化合物（異鼠李素和紫云英苷）的分離度，當(dāng)流速增長(zhǎng)至4mL/min時(shí)，異鼠李素不能得到有效的洗脫。為保證足夠的分離度和較短的分離時(shí)間，最終選擇流速為3mL/min。

圖2 流速對(duì)9種黃酮類化合物保留時(shí)間（A）及峰寬（B）的影響，以及HPLC法和SFC法對(duì)9種黃酮類化合物峰寬（C）和對(duì)稱因子（D）的影響Fig.2 Effects of flow rate on retention times（A）and peak widths（B）of nine flavonoids，effects of HPLC and SFC methods on peak widths（C）and symmetry factors（D）of nine flavonoids

2.1.5 柱溫及背壓從流體密度的角度考慮，在SFC中溫度和背壓通常對(duì)分離結(jié)果有顯著影響。保持其他條件不變，分別考察了不同柱溫（30～50℃）和背壓（10～15MPa）下9種黃酮類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離。結(jié)果顯示，柱溫和背壓對(duì)黃酮類化合物的分離度影響較小，主要影響化合物的保留值。當(dāng)溫度升高時(shí)，超臨界CO2流體的密度降低，流動(dòng)相的溶劑化能力和洗脫能力減弱，導(dǎo)致黃酮類化合物的保留增強(qiáng)；當(dāng)背壓升高時(shí)，超臨界CO2流體的密度增加，流動(dòng)相的溶劑化能力和洗脫能力增強(qiáng)，從而使黃酮類化合物的保留減弱。表明當(dāng)流動(dòng)相中含有添加劑時(shí)，超臨界流體狀態(tài)與亞臨界流體是互通的，此時(shí)溫度和背壓可以保持恒定［19］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定流速為3mL/min，背壓為10MPa。

2.2 SFC法與HPLC法分離結(jié)果的比較

由“2.1.1 ”可知，固定相的選擇對(duì)化合物保留至關(guān)重要。為深入研究9種黃酮類化合物在不同固定相和不同系統(tǒng)中選擇性的區(qū)別，比較了9種黃酮類化合物在SFC和HPLC兩種系統(tǒng)中的選擇性差異。SFC和HPLC的條件如“1.2.3”所示，分離結(jié)果如圖1A及圖3所示。可見(jiàn)，采用SFC法分離9種黃酮類化合物較HPLC法時(shí)間縮短了6倍，在SFC法中9種黃酮類化合物于10min內(nèi)達(dá)到基線分離，而在HPLC法中需60min；同時(shí)SFC法的色譜峰峰寬均小于0.12，而HPLC法的峰寬均大于1，說(shuō)明超臨界流體與液體相比具有較低的粘度；兩種分離方法的對(duì)稱因子幾乎相同，因此具有同樣的分離效率（如圖2C、D所示）。此外，在HPLC中，毛蕊異黃酮和槲皮素、山奈酚和異鼠李素的分離度小于1，在SFC中這兩組化合物可實(shí)現(xiàn)基線分離；在SFC中，異鼠李素和毛蕊異黃酮及山奈酚的分離度小于1，而在HPLC中的分離較好。因此SFC和HPLC兩種色譜法具有互補(bǔ)性。

圖3 9種黃酮類化合物混合對(duì)照品的HPLC圖（A）及供試品的SFC圖（B）Fig.3 HPLC（A）and SFC（B）chromatograms of nine flavonoids mixed reference substances peak numbers denoted were the same as those in Fig.1

一般認(rèn)為SFC法的分離機(jī)理與正相色譜相似，因此，在理論上SFC和HPLC的保留時(shí)間順序相反。然而根據(jù)結(jié)果可知：在HPLC系統(tǒng)中，對(duì)于糖苷類化合物，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、異槲皮苷、芒柄花苷、紫云英苷依次從固定相上洗脫下來(lái)；在SFC中，上述4種化合物以相反的保留時(shí)間順序洗脫；對(duì)于苷元類化合物，根據(jù)其母核可分為異黃酮類（毛蕊異黃酮、芒柄花素）和黃酮類化合物（槲皮素、山奈酚、異鼠李素），在HPLC和SFC系統(tǒng)中，這兩類化合物的保留時(shí)間相反。上述結(jié)果表明，在一定程度上，SFC法與HPLC法具有相反的色譜行為。

2.3 SFC法定量分析

黃芪藥材來(lái)源廣泛，前期研究發(fā)現(xiàn)不同黃芪樣品中含有的活性成分及其含量存在不一致，如黎映瓊等［20］研究表明，芒柄花苷在黃芪根中含量均較葉、莖低，且不同產(chǎn)地的含量差異較大；張妍等［10］研究表明，不同產(chǎn)地黃芪中黃酮類化合物存在較大差異，槲皮素和山奈酚的含量較低；蒲清榮等［21］研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地黃芪中異槲皮苷和芒柄花苷的含量分別為0.0132 ～0.0808 mg/g和0.0021 ～0.0559 mg/g。本研究采用SFC法對(duì)黃芪飲片樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃芪飲片樣品中只檢出5種黃酮類化合物（芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、紫云英苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷）。因此，進(jìn)一步對(duì)上述5種黃酮類化合物進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2.3.1 線性關(guān)系與定量下限 取“1.2.2 ”配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按照1∶2.5 ∶5∶2∶2.5 比例稀釋，得到6個(gè)系列的混合對(duì)照品溶液，按照“1.2.3 ”SFC條件進(jìn)行分析，以黃酮類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。以信噪比（S/N）為10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量下限（LOQ）。由表2可知，芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、紫云英苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r≥0.9632 ；LOQ為10.69 ～16.21 μg/mL。

表2 5種黃酮類化合物的線性關(guān)系及定量下限Table2 Linear relationships and LOQs of5flavonoids

2.3.2 精密度將5種黃酮類化合物的對(duì)照品溶液，按照“1.2.3 ”SFC條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以評(píng)價(jià)日內(nèi)精密度和日間精密度。5種黃酮類化合物的日內(nèi)RSD為1.3 %～2.0 %；日間RSD為1.6 %～2.2 %。結(jié)果表明，本方法具有較好的日間和日內(nèi)精密度，可滿足黃芪藥材中5種黃酮類物質(zhì)的檢測(cè)要求。

2.3.3 重復(fù)性 精密稱取待測(cè)的黃芪樣品6份，按“1.2.1 ”方法制備供試品溶液，在“1.2.3 ”SFC條件下進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算含量。結(jié)果顯示，芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、紫云英苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.9 %、3.6 %、5.9 %、6.4 %、6.0 %。

2.3.4 穩(wěn)定性 取黃芪藥材粉末，按照“1.2.1 ”方法處理樣品，分別于樣品制備后1、4、8、12、24、48h，按照“1.2.3”SFC條件測(cè)定。黃芪藥材中芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、紫云英苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積RSD分別為1.6 %、2.5 %、2.9 %、3.1 %和3.8 %，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加標(biāo)回收率 取黃芪藥材粉末2.0 g，共9份，分別加入對(duì)照品溶液46、92、184μL，配成低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度，每個(gè)濃度平行3份，按“1.2.1”方法進(jìn)行樣品制備并檢測(cè)。計(jì)算得到黃芪藥材中5種黃酮類化合物的回收率為91.8 %～112%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取黃芪藥材粉末2.0 g，按照“1.2.1 ”制備供試品溶液，在“1.2.3 ”SFC條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，芒柄花素、異鼠李素、毛蕊異黃酮、紫云英苷、毛蕊異黃酮苷的含量分別為0.14 、0.024 、0.11 、0.10 、0.09 μg/mg。

根據(jù)2020版中國(guó)藥典規(guī)定，黃芪飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量不少于0.020 %，換算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)即不少于0.2 mg/g［1］。我國(guó)黃芪主產(chǎn)區(qū)主要包括甘肅、山西、內(nèi)蒙古3個(gè)產(chǎn)地，根據(jù)以往研究報(bào)道，不同產(chǎn)區(qū)的黃芪飲片質(zhì)量存在差異［22］，蒲清榮等［21］采用HPLC法測(cè)得不同產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為0.0216 ～0.0238 mg/g；李紫巖等［23］測(cè)定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為0.0220 ～0.1454 mg/g；劉亞令等［24］測(cè)得不同產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為0.004 ～0.034 mg/g。本研究黃芪中的毛蕊異黃酮葡糖糖苷低于中國(guó)藥典規(guī)定的含量范圍，主要是產(chǎn)地差異導(dǎo)致。此外，本文建立的SFC法與傳統(tǒng)的HPLC法相比，分析時(shí)間至少縮短了3倍［7－10］，與TLC法［6］相比更準(zhǔn)確便捷，證明了這種綠色環(huán)保的分析技術(shù)在天然藥物測(cè)定中的應(yīng)用價(jià)值和實(shí)際意義。

3 結(jié) 論

本文建立了一種可在10min內(nèi)快速分析9種黃酮類化合物的SFC方法，討論了色譜柱、改性劑、添加劑、流速、柱溫、背壓等因素的影響，比較了SFC和HPLC兩種色譜模式的選擇性差異，并對(duì)黃芪中5種黃酮類化合物含量進(jìn)行測(cè)定。雖然建立SFC法時(shí)影響化合物分離的因素較多，但研究發(fā)現(xiàn)化合物的分離效果受色譜柱影響顯著，其保留及選擇性受改性劑和添加劑影響大，且添加劑對(duì)色譜峰形的影響明顯。此外，SFC和HPLC這兩種色譜方法具有互補(bǔ)性，在一定程度上，其色譜保留行為相反。雖然由于SFC分離機(jī)制的不確定性和復(fù)雜性，導(dǎo)致無(wú)法快速篩選色譜柱，且存在儀器穩(wěn)定性差、對(duì)樣品的前處理要求相對(duì)較高等缺點(diǎn)。然而作為中藥中的一種新型色譜技術(shù)，SFC仍存在值得挖掘的價(jià)值。